SphK1基因沉默對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞化療敏感性的影響.pdf

1、目的:探討通過慢病毒介導(dǎo)人結(jié)腸腺癌RKO細(xì)胞中的鞘氨醇激酶-1(SphK1)基因沉默后對化療藥物順鉑(DDP)敏感性的影響及其可能的作用機制。
　　方法:通過重組DNA技術(shù)，設(shè)計和合成特異性針對SphK1基因的pLenti6.3-shRNA-SphK1慢病毒表達(dá)載體，同時無義序列pLenti6.3-EGFP慢病毒載體作為陰性對照，感染人結(jié)腸腺癌RKO細(xì)胞株，然后采用殺稻瘟菌素(blasticidin，BSD)來篩選，以獲得穩(wěn)定不變

2、低表達(dá)SphK1基因的單一克隆RKO穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。根據(jù)是否轉(zhuǎn)染，以及轉(zhuǎn)染的處理方式分為SphK1敲低組（shSphK1組）、陰性轉(zhuǎn)染對照組(NC組)，同時將未予轉(zhuǎn)染處理的原始RKO細(xì)胞記作空載對照組(Control組)。為驗證基因的沉默效率，在熒光倒置顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的EGFP（綠色熒光）的表達(dá)情況，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測SphK1的mRNA水平，以及Western blot法檢測SphK1的蛋白表達(dá)水平

3、。根據(jù)是否暴露于DDP，將實驗分為非DDP組和DDP組兩個大組。非DDP組包括shSphK1組、Control組和NC組;DDP組則記為shSphK1+組、Control+組和NC+組。然后以不同劑量（0、2、4、8、16、32μg/ml）的DDP分別作用于細(xì)胞24、48、72小時后，利用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性。采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TU

4、NEL)檢測細(xì)胞凋亡。Western blot法檢驗增殖標(biāo)志蛋白Ki-67以及凋亡標(biāo)記蛋白Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達(dá)變化程度。
　　結(jié)果:在熒光倒置顯微鏡下，shSphK1組和NC組可觀看到多量的EGFP（綠色熒光）的表達(dá)。RT-qPCR法和Western blot法均表明shSphK1組的SphK1表達(dá)顯著低于Control組及NC組。MTT結(jié)果顯示shSphK1組、Control組和NC組細(xì)胞

5、24 h的增殖活性分別為(1.1063±0.0316)、（1.2821±0.0463）、(1.2508±0.0365)，以上三組細(xì)胞48 h的增殖活性分別為（1.1937±0.0347）、（1.5733±0.0554）、(1.5314±0.0572)，三組細(xì)胞72 h的增殖活性分別為(1.2288±0.0495)、（1.6907±0.0785）、(1.6667±0.0658);shSphK1組24、48、72 h的細(xì)胞增殖活力顯著比Co

6、ntrol組及NC組減小，這提示沉默SphK1基因能夠降低RKO細(xì)胞的增殖活力。MTT結(jié)果還顯示以2μg/ml的DDP處理shSphK1+組、Control+組和NC+組細(xì)胞24 h后的細(xì)胞增殖活性分別為（0.7587±0.0422）、(0.9379±0.0535)、(0.9189±0.0512)，48 h的細(xì)胞增殖活性分別為（0.6675±0.0429）、（0.8151±0.0704）、（0.7868±0.0893），72 h的細(xì)胞增

7、殖活性分別為(0.5224±0.0535)、（0.7510±0.0632）、（0.7456±0.0605）;以4μg/ml的DDP處理細(xì)胞24 h后的細(xì)胞增殖活性分別為（0.6332±0.0303）、（0.8561±0.0697）、（0.8364±0.0714），48 h的細(xì)胞增殖活性分別為（0.5236±0.0219）、(0.7121±0.0253)、(0.6971±0.0536)，72 h的細(xì)胞增殖活性分別為(0.4035±0.07

8、09)、（0.6495±0.0375）、（0.6002±0.0218）;以8μg/ml的DDP處理細(xì)胞24 h后的細(xì)胞增殖活性分別為(0.5447±0.0399)、(0.7683±0.0402)、(0.7409±0.0622)，48 h的細(xì)胞增殖活性分別為(0.4343±0.0529)、(0.5938±0.0701)、（0.5576±0.0365），72 h的細(xì)胞增殖活性分別為(0.2781±0.0195)、（0.4725±0.0427

9、）、（0.4543±0.0594）;以16μg/ml的DDP處理細(xì)胞24 h后的細(xì)胞增殖活性分別為(0.4575±0.0622)、(0.6387±0.0899)、(0.6193±0.0323)，48 h的細(xì)胞增殖活性分別為(0.2519±0.0353)、(0.4163±0.0532)、（0.3952±0.0413），72 h的細(xì)胞增殖活性分別為(0.1472±0.0477)、(0.3061±0.0319)、（0.2707±0.0242）

10、;以32μg/ml的DDP處理細(xì)胞24 h后的細(xì)胞增殖活性分別為（0.2867±0.0746）、（0.4519±0.0698）、(0.4298±0.0706)，48 h的細(xì)胞增殖活性分別為（0.1120±0.0493）、(0.2194±0.0389)、（0.1888±0.0439），72 h的細(xì)胞增殖活性分別為(0.0478±0.0073)、（0.1399±0.0231）、（0.1040±0.0365）。以上結(jié)果顯示DDP呈時間和劑量依

11、賴性抑制各組細(xì)胞的增殖，并且在同一濃度的DDP作用相同時間的條件下，shSphK1+組細(xì)胞的增殖能力顯著低于Control+組和NC+組。TUNEL法結(jié)果顯示未予DDP處理的shSphK1組細(xì)胞凋亡率（13.54±2.19）％明顯高于Control組（5.04±1.05）％和NC組(6.15±1.56)％。予8μg/ml的DDP處理shSphK1+組、Control+組和NC+組細(xì)胞24 h后的細(xì)胞凋亡率則分別為（25.91±3.01）

12、％、(18.68±3.16)％、（19.28±2.97）％;予16μg/ml的DDP處理以上三組細(xì)胞24 h后的細(xì)胞凋亡率分別為（55.26±4.71）％、（35.82±3.97）％、（37.52±3.51）％;予32μg/ml的DDP處理三組細(xì)胞24 h的細(xì)胞凋亡率分別為(76.04±4.52)％、（59.60±4.87）％、（62.28±3.11）％;以上結(jié)果說明DDP呈濃度依賴性誘導(dǎo)RKO細(xì)胞凋亡，并且shSphK1+組細(xì)胞的凋亡

13、率明顯高于Control+組和NC+組。Western blot法檢測沉默SphK1后，shSphK1組、Control組和NC組Ki-67蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.9410±0.0437)、（1.1592±0.0753）、（1.1543±0.0981），Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量分別為（0.7317±0.0374）、（0.9180±0.0633）、（0.9205±0.0495），Caspase-9蛋白的相對表達(dá)量分別為（0.4367

14、±0.0757）、（0.2317±0.0593）、(0.2495±0.0435)，Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量分別為（0.6479±0.0762）、(0.3989±0.0499)、（0.3942±0.0614）。以16μg/ml的DDP處理shSphK1+組、Control+組和NC+組細(xì)胞24 h后，Ki-67的相對表達(dá)量分別為(0.3105±0.0367)、（0.8049±0.0684）、（0.8138±0.0596），Bcl

15、-2的相對表達(dá)量分別為（0.2329±0.0389）、（0.5203±0.0312）、（0.5270±0.0497），Caspase-9蛋白的相對表達(dá)量分別為(1.8941±0.1025)、（0.8627±0.0624）、(0.8785±0.0858)，Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量分別為（2.5849±0.1586）、（0.8955±0.0735)、（0.8872±0.0942）。結(jié)果顯示敲低SphK1后，Ki-67和Bcl-2的

16、表達(dá)減弱，Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)增強;經(jīng)DDP處理后，shSphK1+組的Ki-67和Bcl-2蛋白表達(dá)水平較Control+組和NC+組明顯減少; shSphK1+組的Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)水平與Control+組和NC+組相比顯著增強。
　　結(jié)論:沉默SphK1基因可以抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖活力，下調(diào)SphK1基因可能通過抑制Bcl-2的水平和激活Caspase9/3的表達(dá)促進