斑點熱立克次體ompA和ompB基因片段的克隆與表達(dá)及重組蛋白抗原性的研究.pdf

1、斑點熱(spottedfever)是由斑點熱群立克次體(spottedfevergrouprickettsia，SFGR)所引起的一組疾病的總稱。190kDa(外膜蛋白A，OmpA)和120kDa(外膜蛋白B，OmpB)是斑點熱立克次體最主要的表面蛋白抗原，被認(rèn)為是發(fā)展斑點熱的診斷試劑和亞單位疫苗的靶分子。本研究旨在克隆與表達(dá)斑點熱立克次體的ompA和ompB部分基因片段，并對所表達(dá)的重組蛋白的抗原性進(jìn)行研究。采用PCR方法，從斑點熱立

2、克次體的基因組中擴(kuò)增到ompA和ompB基因的基因片段，將兩個基因片段分別與原核表達(dá)載體pQE30連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/ompA和pQE30/ompB。將該重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE鑒定pQE30/ompA和pQE30/ompB轉(zhuǎn)化菌分別表達(dá)了56kDaOmpA和44kDaOmpB重組蛋白。 免疫印跡分析證明立氏立克次體的OmpB重組蛋白僅與立氏立克次體全菌免疫血清發(fā)生

3、特異反應(yīng)。用純化的OmpB重組蛋白免疫家兔，間接免疫熒光試驗(IFA)該重組蛋白能有效地誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生高水平的特異性IgG。IFA分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白免疫血清與立氏立克次體全菌抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其它立克次體的全菌抗原無明顯交叉反應(yīng)。這些結(jié)果說明本次研究制備的OmpB重組蛋白為立氏立克次體種特異性抗原，該重組蛋白免疫血清可以用作檢測立氏立克次體的特異性抗體。 血清學(xué)分析顯示黑龍江立克次體56kDaOmpA重組蛋白能與黑龍江立克次

4、體、立氏立克次體、斑點熱群立克次體精河株等斑點熱立克次體免疫血清發(fā)生交叉反應(yīng)，提示該OmpA重組蛋白具有斑點熱群特異性。用OmpA重組蛋白免疫小鼠和豚鼠，采用IFA檢測免疫動物的血清特異性抗體水平，結(jié)果顯示該OmpA重組蛋白能有效地誘導(dǎo)動物產(chǎn)生較高水平的特異性IgG。為了了解OmpA重組蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，我們采用MTT法分析OmpA免疫小鼠脾細(xì)胞在該抗原刺激下的增殖水平。結(jié)果顯示免疫小鼠脾細(xì)胞在OmpA的刺激下的細(xì)胞增殖水平顯

5、著高于對照，提示OmpA具有T細(xì)胞表位，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。 用黑龍江立克次體和立氏立克次體分別攻擊黑龍江立克次體OmpA重組蛋白免疫豚鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫動物受立克次體攻擊后的發(fā)熱和臟器的病理學(xué)改變顯著輕于非免疫組，說明OmpA重組蛋白免疫既能有效抗擊同源立克次體的攻擊，也能抵抗異種斑點熱立克次體的感染。本次研究結(jié)果顯示OmpA重組蛋白具有良好的免疫原性，能夠有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并