HPV18型E7基因的克隆、表達及其融合蛋白的抗原性研究.pdf

1、目的： 1.利用分子生物學技術(shù)構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7，經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定后，在大腸桿菌中表達HPV18E7融合蛋白。 2.制備HPV18E7融合蛋白診斷抗原，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot法鑒定后，采用ELISA法用該診斷抗原檢測宮頸癌患者血清抗體水平，研究該蛋白的抗原性，為HPV18感染的診斷研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.設(shè)計能擴增HPV18型E7蛋白基因

2、全長序列的PCR引物，并在兩端設(shè)計酶切位點。通過基因克隆方法將PCR產(chǎn)物片段定向插入到原核表達載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7，并經(jīng)酶切、PCR和測序分析對其進行鑒定。 2.將重組質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7轉(zhuǎn)化至E.ColiBL21(DE3)中，經(jīng)誘導表達融合蛋白，并用SDS-PAGE和Westernblot方法分析鑒定。 3.采用Ni-NTAAgarose親和層析

3、柱純化HPV18E7融合蛋白，并以HPV18型陽性血清作為一抗，進一步用Westetrnblot分析該融合蛋白的抗原性。 4.以純化的HPV18F7融合蛋白作診斷抗原，用間接ELISA法檢測宮頸癌患者(88例)、尖銳濕疣患者(65例)及健康對照者77(例)血清IgG抗體。根據(jù)健康對照細血清平均A值計算出陽性判定值(即Cutoff值=健康對照組血清抗體平均A值+2S)，以分析目的蛋白用于診斷HPV18型感染的可行性。 5.

4、統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，進一步兩兩比較用Tamhane法，各組間血清抗體陽性率的比較采用X2檢驗法，顯著性檢驗水平均為0.05。 結(jié)果： 1.經(jīng)酶切、PCR和測序證明成功構(gòu)建pET32a(+)/HPV18E7重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒在大腸桿菌E.ColiBL21(DF3)內(nèi)成功表達了融合蚩向，經(jīng)SDS-PAGF電泳分析見約30kDa大小的蛋白條帶，并經(jīng)Westernblot鑒定為目的蛋白。

5、 2.HPV18E7融合蛋白純化后通過核酸蛋白檢測儀檢測的濃度為450μg/ml；以HPV18E7陽性宮頸癌患者血清作為一抗，經(jīng)Westernblot鑒定HPV18E7融合蛋白具有較強抗原性，成功制備并純化了用于宮頸癌診斷的ELISA抗原。以HPV18E7融合蛋白作為診斷抗原，用間接ELISA方法檢測宮頸癌患者、尖銳濕疣患者和健康對照者血清IgG抗體：①HPV18E7抗體ELISA讀數(shù)均值分別為0.605±0.328、0.287±0.2

6、02和0.342±0.225。三組間差異有顯著性意義(F=32.771，P＜0.001)。用Tamhane法進一步兩兩比較分析結(jié)果顯示：宮頸癌組較尖銳濕疣組及健康對照組HPV18E7抗體均值差異均有顯著性意義(P＜0.01)，而尖銳濕疣組較健康對照組抗體均值差異無顯著性意義(P＞0.05)。②根掘健康對照組血清抗體的平均A值計算Cutoff值(為健康對照組血清抗體平均A值+2S)，HPV18E7抗體陽性率分別為17.0％(15/88)、

7、1.5％(1/65)和1.3％(1/77)。X2檢驗顯示三組間HPV18E7抗體陽性率差異有顯著性意義(X2=17.774，P＜0.01)，宮頸癌組較尖銳濕疣組及健康對照組HPV18E7抗體陽性率差異均有顯著性意義(P＜0.01)，而尖銳濕疣組較健康劉。照組差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7；并在原核細胞表達系統(tǒng)內(nèi)成功表達了融合蛋白。 2.以HP