幽門螺桿菌外膜蛋白HOP25的克隆表達(dá)及其抗原性的體外評(píng)價(jià).pdf

1、背景/目的：幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃腺癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生亦密切相關(guān)。世界衛(wèi)生組織屬下的癌癥研究委員會(huì)1994年已將其列為Ⅰ類致癌原。臨床現(xiàn)有的根除Hp的手段主要是聯(lián)合應(yīng)用抗生素。但由于該菌感染普遍、耐藥菌株不斷增加、花費(fèi)較高以及病人依從性低，限制了抗菌藥物的療效。因此進(jìn)行免疫防治研究十分必要。Hp的疫苗研制工作最早見于1990

2、年，目前已取得了很大進(jìn)展，通過免疫途徑預(yù)防乃至治療Hp感染獲得證實(shí)。然而現(xiàn)存的問題也很突出，目前常用抗原蛋白在常規(guī)免疫佐劑和免疫途徑時(shí)僅能降低細(xì)菌感染量(部分保護(hù))，而無法完全防止感染(完全保護(hù))。外膜蛋白(OuterMembraneProtein，OMP)作為細(xì)菌的表面蛋白，是激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的主要成分，可誘導(dǎo)明顯的菌株特異性免疫反應(yīng)，其作為潛在的靶標(biāo)，在保護(hù)性免疫中有著十分重要的意義，目前也是Hp疫苗研究的重點(diǎn)之一。因此本研究的目的

3、是：選擇Hp外膜蛋白HOP25(Helicobacteroutermembraneprotein25)為免疫原，應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組HOP25原核表達(dá)體系，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA金屬鰲合層析法純化后，獲得純化的重組幽門螺桿菌外膜蛋白25(recombinantHOP25,rHOP25)。并通過體外實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)其抗原性，為進(jìn)一步活體研究奠定基礎(chǔ)。 方法：1)運(yùn)用PCR技術(shù)從Hp(ATCC26695)染色體DNA中擴(kuò)增HOP25

4、編碼基因全長，克隆入表達(dá)載體pET-22b(+)中。以重組pET22b(+)/HOP25為模板進(jìn)行測序并通過Genbank進(jìn)行序列分析。運(yùn)用DNAstar軟件，及Swissport等生物信息數(shù)據(jù)庫對(duì)目的蛋白理化特性及抗原性進(jìn)行分析預(yù)測；2)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET22b一)/HOP25轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21(DE3)pLysS中，用異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(Isopropy-b-D-th

5、iogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA金屬鰲合親和層析及透析脫鹽、超濾濃縮獲得純化的rHOP25，免疫印跡法檢測其抗原性；3)分離Hp陽性及陰性病人外周血T淋巴(PeripheralbloodTcell，PBT)細(xì)胞。用PBT體外增殖實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)rHOP25的抗原性。 結(jié)果：1)成功擴(kuò)增HOP25編碼基因全長，并克隆入表達(dá)載體pET-22b(+)中：經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后顯示，插入

6、片段大小正確。序列分析顯示重組HOP25基因由2085bp組成，開放讀框完整無中斷，相對(duì)應(yīng)目的蛋白長695個(gè)氨基酸，分子量大小約72.4kDa。與GeneBank中Hp(ATCC26695)HOP25編碼序列(AE000621，HP1156)進(jìn)行比較，其同源性為99.7％(2078/2085)。DNAstar生物軟件分析預(yù)測目的蛋白具有良好的抗原性和疏水性；2)成功誘導(dǎo)Hp重組外膜蛋白rHOP25表達(dá)。SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)重組蛋

7、白大小與預(yù)計(jì)相符，以可溶性表達(dá)為主，重組蛋白占全菌蛋白的18％以上。純化后獲得純度大于96％的重組蛋白，免疫印跡顯示該蛋白可被抗HOP25單抗所識(shí)別；3)重組Hp外膜蛋白rHOP25可特異刺激Hp陽性病人的外周血T淋巴細(xì)胞(PBT)增殖，但增殖強(qiáng)度較重組Hp尿素酶蛋白弱。對(duì)Hp陰性病人PBT無明顯作用。 結(jié)論：1)應(yīng)用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建pET22b(+)/HOP25重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA金屬鰲合層