大腦膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元體外感染甲型流感病毒的自噬調(diào)控.pdf

1、研究目的與意義：
　　本研究試圖闡明小鼠大腦膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元體外感染流感病毒或經(jīng)相應(yīng)條件上清處理后的自噬表現(xiàn)，并探究流感病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中的自噬機(jī)制，進(jìn)而對流感相關(guān)腦病的發(fā)生機(jī)制作一些有益的探討。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1．以多個(gè)亞型的流感病毒株分別感染原代培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)分化的Neuro-2a細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞及A549細(xì)胞，以免疫熒光法或免疫印跡法檢測

2、病毒蛋白和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；
　　2．流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元后，經(jīng)超濾處理的條件上清處理新批次的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并檢測其自噬表現(xiàn)；
　　3．以血凝實(shí)驗(yàn)或病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)上清中的病毒產(chǎn)量；
　　4．實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用自噬抑制劑氯喹檢測相應(yīng)處理因素下的自噬流表現(xiàn)；
　　5．應(yīng)用自噬相關(guān)藥物（氯喹、雷帕霉素、氯化銨、3-甲基腺嘌呤等）處理相關(guān)細(xì)胞，檢測藥物處理對病毒復(fù)制的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　

3、　1．流感病毒H3N2/ST602感染的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞較對照細(xì)胞形成更強(qiáng)的自噬流；
　　2．人流感病毒H1N1/ST169、H3N2/ST602或禽流感病毒H9N2/G1感染的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞較對照細(xì)胞均有更強(qiáng)的自噬流，同時(shí)G1感染的細(xì)胞自噬明顯增強(qiáng)；
　　3．小鼠神經(jīng)元感染流感病毒后，胞內(nèi)LC3B蛋白點(diǎn)狀聚集減弱；
　　4．流感病毒感染的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件上清能發(fā)揮一定程度的細(xì)胞自噬負(fù)性調(diào)控；
　　5．H3N2

4、/ST364感染后已產(chǎn)生明顯病變效應(yīng)的神經(jīng)元的條件上清，對星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯自噬激活作用；
　　6．流感病毒H1N1/WSN在原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和成熟神經(jīng)元內(nèi)的復(fù)制均受限，而在尚未分化成熟的神經(jīng)元內(nèi)可有效復(fù)制；
　　7．人流感病毒H1N1/WSN、H3N2/ST364及禽流感病毒H9N2/G1、H9N2/G9可在維甲酸誘導(dǎo)分化的小鼠神經(jīng)元細(xì)胞系Neuro-2a細(xì)胞及未經(jīng)分化的人神經(jīng)元細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；<

5、br>　　8．流感病毒感染的Neuro-2a細(xì)胞及SH-SY5Y細(xì)胞的自噬激活與自噬流均減弱；
　　9．氯喹促進(jìn)流感病毒H1N1/WSN、H1N1/PR8、H9N2/G1及H9N2/G9在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，該效應(yīng)與自噬機(jī)制有關(guān)；
　　10．氯喹可促進(jìn)甲型流感病毒H1N1/WSN在人肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，該效應(yīng)與氯喹藥物濃度、作用時(shí)間、感染復(fù)數(shù)及自噬機(jī)制有關(guān)；
　　11．氯喹加重流感病毒感染的A54

6、9細(xì)胞產(chǎn)生的病變效應(yīng)，該效應(yīng)與氯喹所增進(jìn)的病毒復(fù)制有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1．小鼠大腦神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞體外感染流感病毒后，伴隨靈敏的自噬反應(yīng)；
　　2．流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元的條件上清，可調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬狀態(tài)；
　　3．自噬機(jī)制參與流感病毒在神經(jīng)元細(xì)胞系Neuro-2a與SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程；
　　4．氯喹促進(jìn)流感病毒在SH-SY5Y細(xì)胞與A549細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，該效應(yīng)與自噬機(jī)制有關(guān)