大腦膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元體外感染甲型流感病毒的自噬調(diào)控.pdf

1、研究目的與意義：
　　本研究試圖闡明小鼠大腦膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元體外感染流感病毒或經(jīng)相應條件上清處理后的自噬表現(xiàn)，并探究流感病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關細胞內(nèi)復制過程中的自噬機制，進而對流感相關腦病的發(fā)生機制作一些有益的探討。
　　實驗方法：
　　1．以多個亞型的流感病毒株分別感染原代培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、經(jīng)維甲酸誘導分化的Neuro-2a細胞、SH-SY5Y細胞及A549細胞，以免疫熒光法或免疫印跡法檢測

2、病毒蛋白和自噬相關蛋白的表達；
　　2．流感病毒感染星形膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元后，經(jīng)超濾處理的條件上清處理新批次的星形膠質(zhì)細胞，并檢測其自噬表現(xiàn)；
　　3．以血凝實驗或病毒空斑實驗檢測培養(yǎng)上清中的病毒產(chǎn)量；
　　4．實驗過程中應用自噬抑制劑氯喹檢測相應處理因素下的自噬流表現(xiàn)；
　　5．應用自噬相關藥物（氯喹、雷帕霉素、氯化銨、3-甲基腺嘌呤等）處理相關細胞，檢測藥物處理對病毒復制的影響。
　　實驗結果：
　

3、　1．流感病毒H3N2/ST602感染的小鼠小膠質(zhì)細胞較對照細胞形成更強的自噬流；
　　2．人流感病毒H1N1/ST169、H3N2/ST602或禽流感病毒H9N2/G1感染的小鼠星形膠質(zhì)細胞較對照細胞均有更強的自噬流，同時G1感染的細胞自噬明顯增強；
　　3．小鼠神經(jīng)元感染流感病毒后，胞內(nèi)LC3B蛋白點狀聚集減弱；
　　4．流感病毒感染的星形膠質(zhì)細胞的條件上清能發(fā)揮一定程度的細胞自噬負性調(diào)控；
　　5．H3N2

4、/ST364感染后已產(chǎn)生明顯病變效應的神經(jīng)元的條件上清，對星形膠質(zhì)細胞有明顯自噬激活作用；
　　6．流感病毒H1N1/WSN在原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細胞和成熟神經(jīng)元內(nèi)的復制均受限，而在尚未分化成熟的神經(jīng)元內(nèi)可有效復制；
　　7．人流感病毒H1N1/WSN、H3N2/ST364及禽流感病毒H9N2/G1、H9N2/G9可在維甲酸誘導分化的小鼠神經(jīng)元細胞系Neuro-2a細胞及未經(jīng)分化的人神經(jīng)元細胞系SH-SY5Y細胞內(nèi)復制；<

5、br>　　8．流感病毒感染的Neuro-2a細胞及SH-SY5Y細胞的自噬激活與自噬流均減弱；
　　9．氯喹促進流感病毒H1N1/WSN、H1N1/PR8、H9N2/G1及H9N2/G9在SH-SY5Y細胞內(nèi)的復制，該效應與自噬機制有關；
　　10．氯喹可促進甲型流感病毒H1N1/WSN在人肺上皮細胞系A549細胞內(nèi)的復制，該效應與氯喹藥物濃度、作用時間、感染復數(shù)及自噬機制有關；
　　11．氯喹加重流感病毒感染的A54

6、9細胞產(chǎn)生的病變效應，該效應與氯喹所增進的病毒復制有關。
　　結論：
　　1．小鼠大腦神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞體外感染流感病毒后，伴隨靈敏的自噬反應；
　　2．流感病毒感染星形膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元的條件上清，可調(diào)控星形膠質(zhì)細胞的自噬狀態(tài)；
　　3．自噬機制參與流感病毒在神經(jīng)元細胞系Neuro-2a與SH-SY5Y細胞內(nèi)復制的過程；
　　4．氯喹促進流感病毒在SH-SY5Y細胞與A549細胞內(nèi)的復制，該效應與自噬機制有關