脫氧核酶抑制甲型流感病毒復(fù)制的體外研究.pdf

1、流行性感冒病毒(Influenzavires，IFV)，簡(jiǎn)稱(chēng)流感病毒，是引起流行性感冒的病原體。流感長(zhǎng)期以來(lái)一直嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，禽流感等可以跨越種屬差異，由禽類(lèi)傳染人類(lèi)，給人類(lèi)的生命、財(cái)產(chǎn)安全都帶來(lái)更大的威脅，引起了全球各界的高度重視。因此，開(kāi)展流感病毒的研究和防治具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 疫苗接種是目前預(yù)防病毒性疾病的有效措施。但由于流感病毒表面抗原容易發(fā)生變異，致使疫苗預(yù)防流感效果欠佳?，F(xiàn)在所

2、應(yīng)用的抗流感藥物主要有金剛烷胺類(lèi)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)抑制劑類(lèi)兩類(lèi)藥物，由于它們的毒副作用，限制了臨床中的應(yīng)用。因此開(kāi)發(fā)更安全、有效的新型的抗流感病毒藥物已勢(shì)在必行。 對(duì)流感病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵作用的RNA聚合酶(由PBl，PB2和PA三個(gè)亞基組成)，在流感病毒的生活周期中發(fā)揮著重要作用，其中聚合酶堿性蛋白1(PBl)亞基具有RNA聚合酶活性，既參與mRNA轉(zhuǎn)錄又參與病毒RNA(vRNA)的復(fù)制，并催化

3、新合成的RNA鏈延伸，變異性相對(duì)較小?？梢宰鳛橐环N潛在的抗流感病毒藥物的作用靶點(diǎn)，國(guó)外已有針對(duì)PBl-mRNA反義寡聚核苷酸(ASO)用于抑制病毒復(fù)制的研究，其在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)具有較好的切割效果。 CPE)的抑制作用；MTT定量比色法觀察DZ對(duì)細(xì)胞CPE形成和細(xì)胞存活率的影響；空斑形成試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)病毒滴度的影響；RT-PCR測(cè)流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)mRNA的表達(dá)；MDCK-ELISA方法測(cè)流感病毒蛋白的表達(dá)

4、。 結(jié)果 1、甲型流感病毒特異性脫氧核酶的設(shè)計(jì)、合成：通過(guò)比對(duì)26株10余種亞型甲型流感病毒PBl．mRNA的全長(zhǎng)序列發(fā)現(xiàn)，在起始密碼子上、下游約60個(gè)堿基的序列高度保守，以PBl-mRNA起始密碼子AUG作為靶點(diǎn)合成了臂長(zhǎng)為10nt的PBl．DZ，在化學(xué)合成過(guò)程中對(duì)5’和3’端的2個(gè)核苷酸進(jìn)行了硫代修飾(PBl．DZ-S)，提高PBl．DZ的胞內(nèi)穩(wěn)定性。以針對(duì)相同底物的反義寡核苷酸(PBl-ASO)為對(duì)照。2、PBl一

5、DZ無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的切割效應(yīng)：PBl-DZ能在靶RNA一一P．B1．mRNA起始密碼子AUG的AIU之間切割RNA底物，將體外轉(zhuǎn)錄獲得的170nt的底物RNA切割為100nt和70nt的兩段目的產(chǎn)物。在反應(yīng)60、90、120、240和480分鐘后，其切割效率分別為24．85％、35．72％、54．47％、58．81％和63．54％，表明PBl-DZ在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)底物RNA的切割作用具有時(shí)間依賴(lài)性。 3、DZ在細(xì)胞內(nèi)抑制甲型流感病毒復(fù)

6、制的效應(yīng)：PBl．DZ在濃度為0．25-3gM的范圍內(nèi)能抑制流感病毒的復(fù)制，并呈劑量依賴(lài)性；其作用優(yōu)于對(duì)照PBl．ASO而弱于PBl．DZ-S：(1)PBl-DZ能明顯抑制流感病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，隨著DZ濃度增加，CPE也逐漸減輕，而PBl．ASO僅顯示出輕微的CPE抑制作用。(2)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PBl-DZ和PBl．DZ-S在濃度為0．5[tM時(shí)即能保護(hù)病毒感染細(xì)胞，分別使細(xì)胞存活率增加到50％和54％。DZ對(duì)細(xì)胞的保

7、護(hù)作用呈濃度依賴(lài)性，在PBl一DZ和PBl-DZ-S濃度增加到3[tM時(shí)，細(xì)胞存活率有大幅 脫氧核酶是具有RNA切割功能的DNA分子，是通過(guò)對(duì)體外合成的隨機(jī)序列進(jìn)行篩選獲得的，其中“10-23”型脫氧核酶(deoxyribozyme，DZ)功能最強(qiáng)。此酶由一個(gè)15個(gè)核苷酸(nucleotident，nt)的催化中心和與靶RNA堿基互補(bǔ)的兩個(gè)側(cè)翼序列構(gòu)成，能在靶RNA未配對(duì)的嘌呤和配對(duì)的嘧啶殘基之間發(fā)生序列特異性切割。作為一種新型

8、的分子生物學(xué)工具在病毒感染的預(yù)防和治療方面已取得重大的突破。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)針對(duì)不同靶點(diǎn)的反義寡核苷酸或脫氧核酶抑制流感病毒復(fù)制均有一些研究報(bào)道，而選擇PBl．mRNA起始區(qū)作為脫氧核酶作用靶點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。 本研究針對(duì)甲型流感病毒PBl．mRNA起始區(qū)設(shè)計(jì)了特異性脫氧核酶PBl．DZ，觀察其在無(wú)細(xì)胞體系切割PBl．mRNA的作用；在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中驗(yàn)證、與反義寡核苷酸比較了抑制病毒復(fù)制、保護(hù)宿主細(xì)胞的效應(yīng)。 方法

9、 度的提高，增加到81％和83％(與病毒對(duì)照相比P<0．05)，PBl．ASO處理組即使?jié)舛仍?vM時(shí)，細(xì)胞存活率的值仍然低于50％(與PBl．DZ和PBl．DZ-S相比差別有顯著性，P<0．05)。(3)在0．5-3vM的濃度范圍內(nèi)，病毒空斑抑制率在PBl．DZ處理組由30．3％上升到59．1％，PBl．DZ-S處理組由45．5％上升到77．3％，與濃度呈明顯正相關(guān)，校正相關(guān)系數(shù)為0．94(P<0．01)，而PBl．ASO處理組變化不

10、大，病毒空斑抑制率均在50％以下。(4)在0．25-3lam的濃度范圍內(nèi)，MDCK-ELISA方法發(fā)現(xiàn)PBl．DZ及PBl-DZ-S對(duì)病毒M蛋白的表達(dá)均有顯著的抑制作用，蛋白表達(dá)抑制率最大可達(dá)到44．5％和71．3％，與病毒對(duì)照相比差別有顯著性(P<0．01)，PBl．ASO在濃度>0．5lam時(shí)才有抑制作用。在2lam時(shí)，PBl-DZ組病毒蛋白表達(dá)抑制率(43．5％)與PBl．ASO組(33．7％)相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0．05

11、。RT-PCR也證實(shí)PBl．DZ抑制病毒HAmRNA表達(dá)，抑制率與濃度呈明顯相關(guān)性，R=0．809，P<0．05。 結(jié)論 本研究設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)甲型流感病毒PBl．mRNA的起始密碼子AUG的脫氧核酶PBl-DZ、硫代修飾PBl-DZ-S、對(duì)照PBl．ASO；PBl．DZ在細(xì)胞外能有效切割底物RNA；在MDCK細(xì)胞內(nèi)也能抑制病毒復(fù)制及病毒RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，保護(hù)宿主細(xì)胞，抑制作用明顯優(yōu)于PBl一ASO，而硫代修飾更能加