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文檔簡介
1、目的:
本課題通過腹腔內(nèi)注射混合活菌株建立膿毒癥、嚴重膿毒癥大鼠模型,研究銅綠假單胞菌菌毛甘露糖敏感血凝素(PA-MSHA)預(yù)處理對膿毒癥及嚴重膿毒癥大鼠腸組織和腹腔灌洗液細胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10)的影響;對腸道ICAM-1、VCAM-1表達的影響;對外周血中性粒細胞表面TLR4表達的影響;對外周血中性粒細胞體外趨化的影響。旨在探討PA-MSHA對膿毒癥/嚴重膿毒癥大鼠腸道損傷的可能預(yù)防機制。
2、> 方法:
?。?)選取健康清潔SPF級雄性SD大鼠40只(230±10g),將大鼠隨機分為5組:空白組、膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組。
(2)預(yù)給藥:連續(xù)給藥7天,空白組、膿毒癥組、嚴重膿毒癥組分別給予0.9%氯化鈉注射液(0.3ml/只/天背部皮下注射);PA-膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組分別給予(PA-MSHA0.3ml/只/天背部皮下注射)。
?。?)第8天造模,空白組取
3、3ml0.9%氯化鈉注射液經(jīng)大鼠右下腹腹腔注射;膿毒癥組、PA-膿毒癥組取1.6ml/kg糞便懸液(根據(jù)Gonnert FA人糞便懸液腹腔注射法改良預(yù)先制備好),0.9%氯化鈉注射液稀釋至3 mL,經(jīng)大鼠右下腹腹腔注射;嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組取4ml/kg糞便懸液,0.9%氯化鈉注射液稀釋至3mL,經(jīng)大鼠右下腹腹腔注射。
?。?)模型建立成功后,用3%戊巴比妥鈉注射液麻醉大鼠,監(jiān)測大鼠平均動脈壓。I、腹腔灌洗并回收腹腔
4、灌洗液(回收率≥80%),ELISA法測定細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10的濃度。II、腹主動脈取血行血培養(yǎng)、分離中性粒細胞通過流式細胞儀檢測中性粒細胞表面TLR4表達;Transwell小室法測中性粒細胞體外趨化個數(shù)。III、動物處死后,留取遠端空腸組織約2cm行HE染色,光鏡下觀察組織病理形態(tài)變化。IV、另留取距離十二指腸球部遠端10cm處空腸組織約2cm,勻漿后通過ELISA測細胞因子(IL-1、IL-6、TNF
5、-α、IL-10)和粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)的濃度。
結(jié)果:
(1)平均動脈壓及血培養(yǎng):與空白組比較,膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組4組平均動脈壓明顯降低。空白組血培養(yǎng)無細菌生長;其余4組血培養(yǎng)結(jié)果均為大腸埃希菌(+)。
(2)病理學(xué)改變:解剖后,空白組腸管呈粉紅色,血供良好;其余4組均有不同程度腸壁色澤變暗、充血、水腫、積氣或粘連。石蠟切片HE染色:空白組腸上皮細
6、胞完整,上皮和固有層連接緊密無縫隙,無炎癥細胞浸潤,腸腺體正常;其余4組均有不同程度的上皮細胞破壞、炎細胞浸潤、固有層水腫和毛細血管擴張。
?。?)腹腔灌洗液細胞因子濃度:
?、俅傺滓蜃樱↖L-1、IL-6、TNF-α)濃度:與空白組比較,膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組促炎因子濃度均升高(P<0.05);其中嚴重膿毒癥組高于膿毒癥組(P<0.05);膿毒癥組高于PA-膿毒癥組(P<0.05);
7、嚴重膿毒癥組高于PA-嚴重膿毒癥組(P<0.05)。
?、谝盅滓蜃樱↖L-10)濃度:與空白組比較,膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組均升高(P<0.05);進一步比較,膿毒癥組IL-10濃度高于PA-膿毒癥組(P<0.05);嚴重膿毒癥組高于PA-嚴重膿毒癥組(P<0.05)。
?。?)腸組織細胞因子和粘附分子濃度:
①促炎因子(IL-1、IL-6、TNF-α)濃度:與正常組比較,膿毒
8、癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組促炎因子濃度均升高(P<0.05);其中嚴重膿毒癥組高于膿毒癥組(P<0.05);膿毒癥組高于PA-膿毒癥組(P<0.05);嚴重膿毒癥組高于PA-嚴重膿毒癥組(P<0.05)。
?、谝盅滓蜃樱↖L-10)濃度:與正常組比較,膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組均升高(P<0.05);膿毒癥組IL-10濃度低于PA-膿毒癥組(P<0.05);嚴重膿毒癥組
9、低于PA-嚴重膿毒癥組(P<0.05)。
?、奂毎掣椒肿樱↖CAM-1、VCAM-1)濃度:與空白組相比,膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組腸道ICAM-1、VCAM-1濃度均升高(P<0.05);其中膿毒癥組ICAM-1、VCAM-1表達濃度高于PA-膿毒癥組(P<0.05);但嚴重膿毒癥組VCAM-1表達水平與PA-嚴重膿毒癥組相比無明顯變化(P=0.262)。
?。?)流式細胞儀檢測外周血
10、中性粒細胞表面TLR4表達:與空白組比較,膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組TLR4表達均升高(P<0.05);膿毒癥組TLR4表達低于嚴重膿毒癥組;膿毒癥組高于PA-膿毒癥組(P<0.05);嚴重膿毒癥組高于PA-嚴重膿毒癥組(P<0.05)。
(6)Transwell小室法測中性粒細胞體外趨化個數(shù):與空白組比較,膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組中性粒細胞體外趨化個數(shù)均減少(
11、P<0.05);嚴重膿毒癥組趨化個數(shù)少于膿毒癥組(P<0.05);膿毒癥組個數(shù)少于PA-膿毒癥組(P<0.05);嚴重膿毒癥組個數(shù)少于PA-嚴重膿毒癥組(P<0.05)。
結(jié)論:
1、腹腔感染引起的膿毒癥/嚴重膿毒癥可導(dǎo)致大鼠腹腔、腸道局部細胞因子水平升高;PA-MSHA預(yù)處理可通過降低局部細胞因子濃度,減輕膿毒癥大鼠腸道炎癥損害,預(yù)防膿毒癥。
2、腹腔感染引起的膿毒癥/嚴重膿毒癥均可使大鼠腸道ICAM-1
12、、VCAM-1表達水平升高;PA-MSHA預(yù)給藥能通過抑制膿毒癥大鼠腸道ICAM-1、VCAM-1的表達水平,從而在一定程度上減輕、中度膿毒癥大鼠腸道炎癥反應(yīng)。
3、PA-MSHA預(yù)給藥能抑制中性粒細胞表面TLR4及其下游信號通路的表達,改善中性粒細胞免疫麻痹,增加中性粒細胞體外移行個數(shù),從而降低全身炎癥水平,減少組織損傷。
4、PA-MSHA預(yù)給藥能通過減輕全身和局部(腹腔、腸道)炎癥反應(yīng),從而對膿毒癥引起的腸道損
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