KLK4在子宮內膜腺癌中的表達和對RL95-2細胞侵襲的影響研究.pdf

1、背景：
　　子宮內膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，由于癥狀出現(xiàn)較早，大多數(shù)患者能夠早期診斷，經(jīng)過手術治療后整體預后較好，但仍有部分患者出現(xiàn)手術后腫瘤復發(fā)或早期轉移，成為這部分患者預后較差的主要原因。目前已發(fā)現(xiàn)諸多和子宮內膜癌預后相關的分子標志物，如PTEN、P53、Ki67、K-ras等，但在臨床上的應用仍有很多局限性。
　　人組織激肽釋放酶（Kallikrein，KLK）屬于絲氨酸蛋白酶家族，

2、由KLK1-15構成，近年來發(fā)現(xiàn)KLK家族的成員涉及腫瘤的增殖、侵襲、耐藥等多方面功能。KLK4是近些年KLK家族中研究較熱的分子，其獨特之處在于KLK4表達于細胞核，而其他的KLK家族成員表達于細胞質。已發(fā)現(xiàn)KLK4在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌中呈高表達，且能促進前列腺癌細胞的增殖和卵巢癌細胞的侵襲轉移，機制研究表明KLK4能調節(jié)細胞周期蛋白的表達，促進腫瘤細胞上皮間質轉化，且KLK4的表達受性激素的調節(jié)。目前已有報道KLK4在子宮內膜

3、癌中高表達，但具體的作用和機制未知。
　　子宮內膜癌是典型的激素依賴性腫瘤，基于KLK4在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌中的作用，我們考慮KLK4在子宮內膜癌中也可能存在一定作用。在本實驗中，我們分別從KLK4在子宮內膜癌中的表達和臨床病理參數(shù)及預后之間的關系，對子宮內膜癌細胞功能的影響及可能的機制等幾個層面做了探討。
　　第一部分、KLK4在子宮內膜癌中的表達及臨床意義
　　目的：探討KLK4在子宮內膜癌中的表達及臨床意義

4、，為改善子宮內膜癌的預后提供新的思路。
　　方法：免疫組化法檢測81例子宮內膜癌、30例不典型增生的子宮內膜和30例正常子宮內膜中KLK4的表達情況，收集患者臨床病理資料，結合隨訪資料做生存分析，得出KLK4的表達和子宮內膜癌預后的關系。
　　結果：KLK4主要定位在細胞核，在正常內膜、不典型增生內膜和子宮內膜癌中的高表達率分別為30％、53%、67%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）；KLK4的高表達和子宮內膜癌的分化程

5、度及深肌層浸潤相關（P=0.021，P=0.031），與年齡、臨床分期、淋巴結轉移無關；KLK4高表達組的5年無進展生存率較低表達組更低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.032）。
　　結論：KLK4的高表達可能與子宮內膜癌細胞的分化程度和局部侵襲有關，高表達提示早期復發(fā)，有可能作為預測子宮內膜癌早期復發(fā)的標志物。
　　第二部分、KLK4在子宮內膜癌細胞中的表達和雌激素對KLK4的調節(jié)作用
　　目的：探討KLK4在子宮內膜癌

6、細胞中的表達情況及雌激素對KLK4表達的影響
　　方法：Real-time PCR及Western blot檢測KLK4mRNA及蛋白在Ishikawa、HEC-1B及RL95-2細胞中的表達。用不含雌激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)Ishkawa細胞，分別加入10-10mol/L、10-8mol/L及10-6mol/L的17-β雌二醇培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h檢測KLK4mRNA及蛋白的表達量。再以最佳作用濃度的雌激素聯(lián)合10-9mol

7、/L、10-7mol/L及10-5mol/L的雌激素受體拮抗劑ICI182,780作用于Ishkawa細胞，觀察雌激素受體拮抗劑對KLK4表達的影響。
　　結果：KLK4在子宮內膜癌細胞中的表達強度由高到低依次為HEC-1B、Ishikawa、RL95-2。雌激素能促進Ishkawa細胞中KLK4的表達，以10-8mol/L作用48h最明顯。ICI182,780能阻斷雌激素對KLK4表達的上調作用，當濃度為10-7mol/L時阻斷

8、效果最明顯。
　　結論：雌激素能夠上調子宮內膜癌細胞中KLK4的表達，雌激素受體拮抗劑能阻斷雌激素對KLK4表達的上調作用。推測雌激素能夠通過雌激素受體促進子宮內膜癌細胞中KLK4的表達。
　　第三部分、過表達KLK4對子宮內膜癌細胞功能的影響
　　目的：探討KLK4在子宮內膜癌細胞中可能存在的作用。
　　方法：以pcDNA3.1(+)為載體構建KLK4過表達質粒，轉染至KLK4低表達的RL95-2細胞，通過G4

9、18連續(xù)篩選獲得穩(wěn)定過表達KLK4的RL95-2細胞。MTT法檢測過表達KLK4對RL95-2細胞增殖的影響，劃痕實驗及transwell侵襲實驗檢測過表達KLK4對RL95-2細胞體外遷移及侵襲能力的影響。
　　結果：成功構建KLK4的過表達質粒并建立穩(wěn)定過表達KLK4的細胞系。MTT實驗顯示過表達KLK4不能促進RL95-2細胞的增殖，但劃痕實驗及transwell侵襲實驗顯示其體外遷移和侵襲能力較對照組明顯增加。
　　

10、結論：KLK4過表達能促進RL95-2細胞的體外遷移及侵襲能力，但不能促進其增殖。
　　第四部分、過表達KLK4促進RL95-2細胞侵襲機制的初步研究
　　目的：初步探討過表達KLK4促進RL95-2細胞體外侵襲的可能機制。
　　方法：Real-time PCR、Western blot及免疫熒光檢測過表達KLK4后e-cadherin mRNA及蛋白的表達變化。構建e-cadherin的過表達質粒，瞬時轉染入穩(wěn)定過表