產(chǎn)鄰苯二酚菌株的篩選及相關(guān)基因的克隆.pdf

1、本工作從土壤中篩選到一株能利用苯甲酸鈉產(chǎn)鄰苯二酚的假單胞菌株B3-1。通過(guò)對(duì)菌株B3-1在不同底物濃度、溫度和pH條件下產(chǎn)鄰苯二酚條件的優(yōu)化，鄰苯二酚產(chǎn)量最高能達(dá)到1.57mg/mL，其最適生長(zhǎng)條件為32℃、pH 6.0～7.0，產(chǎn)鄰苯二酚的最佳底物濃度為3mg/mL。 以假單胞菌B3-1為出發(fā)菌株，進(jìn)行了固定化細(xì)胞生產(chǎn)鄰苯二酚的初步研究。通過(guò)明膠、海藻酸鈉和聚乙烯醇三種固定化材料的比較，最終確定了使用海藻酸鈉作為固定化載體。通

2、過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，固定化的最佳條件為：菌體量0.3 g/mL；氯化鈣濃度為4％；海藻酸鈉濃度為3％；鈣化時(shí)間為4小時(shí)。 用柯斯質(zhì)粒pWEB::TNC為載體構(gòu)建了Pseudomonas sp．B3-1含約20000個(gè)克隆的基因組文庫(kù)，隨機(jī)挑取其中的14個(gè)克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHI酶切分析，結(jié)果顯示所有的質(zhì)粒都含有插入片段，最大為52kb，最小為31kb，平均大小為41.5 kb，14個(gè)質(zhì)粒的酶切帶型都不相同，說(shuō)明文庫(kù)克隆的外源DNA片段

3、隨機(jī)性比較大。 通過(guò)活性篩選得到含編碼鄰苯二酚合成基因的陽(yáng)性克隆45個(gè)。從陽(yáng)性克隆Ben19中得到苯甲酸雙加氧酶基因benABCD， BlastX表明該序列與來(lái)自于Pseudomonas entomophila str.L48(GenBank索引號(hào)：CT573326)的苯甲酸雙加氧酶ben基因簇有91％的同源性。benA具有一個(gè)1329bp的ORF，可編碼含442個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，編碼產(chǎn)物與來(lái)自假單胞菌的苯甲酸鈉雙加氧酶BeIt

4、A(GenBank索引號(hào)AAX47023.1)具有96％一致性和99％相似性。benB具有一個(gè)486bp的ORF，編碼含161個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，編碼產(chǎn)物與來(lái)自Pseudomonas entomophila str.L48的苯甲酸鈉雙加氧酶BenB(GenBank索引號(hào)AAX47024.1)具有91％一致性和97％相似性。benC具有一個(gè)1011bp的ORF，編碼含336個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，編碼產(chǎn)物與來(lái)自假單胞菌的苯甲酸鈉雙加氧酶BenC(