產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株胞外酶調(diào)控相關(guān)基因ctp的克隆及功能分析.pdf

1、菌株OH11是從本試驗(yàn)室從辣椒根際土壤中分離得到的一種新型生防細(xì)菌，是國內(nèi)首次報(bào)道的一株產(chǎn)酶溶桿菌（Lysobacter enzymogenes），屬于黃單胞科（Xanthomonadaceae），溶桿菌屬（Lysobacter）。該菌富含G+C，有滑行現(xiàn)象，能產(chǎn)生多種胞外酶，包括幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶等，對(duì)許多植物病原真菌、卵菌及線蟲等都有很好的拮抗活性，具有廣闊的應(yīng)用前景。雖然國內(nèi)外的研究已證實(shí)胞外酶是該菌

2、重要的拮抗因子，但對(duì)于不同胞外酶的產(chǎn)生是否依賴于調(diào)控基因的操縱?這些調(diào)控基因有何生防功能等問題仍沒有得到很好的解答。鑒于此，本研究以O(shè)H11菌株為研究對(duì)象，克隆該菌株中調(diào)控4種胞外酶產(chǎn)生的相關(guān)基因，并對(duì)克隆的基因進(jìn)行功能分析，以明確這些基因在該菌株拮抗活性和生物防治中的作用。
　　 利用mariner轉(zhuǎn)座子對(duì)產(chǎn)酶溶桿菌OH11進(jìn)行轉(zhuǎn)座誘變，構(gòu)建產(chǎn)酶溶桿菌OH11的突變體文庫。通過突變株在四種不同的胞外酶（蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)

3、酶、β-1，3-葡聚糖酶）檢測(cè)培養(yǎng)基上降解圈的大小來判斷突變株是否缺失或降低了相應(yīng)胞外酶的產(chǎn)生這一方法，從5000多株突變株中篩選到一株對(duì)四種胞外酶的產(chǎn)生均有大幅減少的突變株D-11。通過亞克隆的方法，鑒定了mariner轉(zhuǎn)座子在細(xì)菌染色體上的插入位點(diǎn)為一個(gè)編碼羧基末端蛋白酶（carboxy-terminal protease）基因ctp。序列分析表明：該基因全長2214bp，G+C％為69％，在蛋白質(zhì)水平上與StenotrophDmo

4、nas maltophilia菌株的Ctp序列同源性達(dá)79％，與Xanthomonas campetris菌株的Ctp序列同源性達(dá)。78％。
　　 利用自殺載體pEX18GM，通過同源重組的方法，構(gòu)建了印基因定向缺失突變體△ctp，通過基因互補(bǔ)，構(gòu)建了△ctp的互補(bǔ)菌株△ctp（pBBR-PBCTP）。對(duì)突變體的特性研究后發(fā)現(xiàn)，（1）突變體△ctp與野生型OH11在營養(yǎng)豐富型（2YT）與營養(yǎng)缺陷型（MMX）培養(yǎng)基中生長速率基本一

5、致；（2）突變體△ctp降低了蛋白酶、纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶的產(chǎn)生量，但是對(duì)幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生并沒有影響；（3）突變體△ctp明顯減少了OH11生物膜的產(chǎn)生量；（4）突變體△ctp改變了其在羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基與昆布多糖固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，野生型呈現(xiàn)光滑飽滿的黃色菌落，相比之下突變體則明顯的干燥偏小，且菌落周圍粗糙不光滑。研究還表明，突變體雖然在一定程度上降低了OH11胞外水解酶的產(chǎn)生量，但是基本不改變其對(duì)油菜菌核病菌、水稻紋