外周循環(huán)血微小RNA表達(dá)水平與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD），又稱冠心病（coronary heart disease， CHD），已經(jīng)成為人群死亡的最主要病因。多年的臨床與基礎(chǔ)相關(guān)研究證實(shí)，冠心病是一種免疫、環(huán)境與遺傳等多因素交互作用的炎癥性疾病，血流動(dòng)力學(xué)變化、感染、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等因素都可加重其病程。由于冠心病發(fā)生的危險(xiǎn)因素及發(fā)病機(jī)制相對(duì)比較復(fù)雜，具有種族差異和遺傳異質(zhì)性等因素，因此，為了對(duì)冠心病進(jìn)行

2、早期診斷以及早期預(yù)防，對(duì)其內(nèi)在發(fā)病機(jī)制以及相互影響的研究一直鍥而不舍地進(jìn)行著。期望通過(guò)研究找到能夠更好的阻止該病的發(fā)展的重要因素，使得患者的治愈率和生存率得到提高。
　　以往研究發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)血中存在多種微小RNA（MicroRNAs，miRNAs），且與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等疾病密切相關(guān)。
　　miRNAs是一類高度保守的內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA，約含20～24個(gè)寡核苷酸，結(jié)構(gòu)以及物種保守性非常高，無(wú)論是時(shí)序性還是組織特

3、異性都很嚴(yán)格，因此，幾乎存在于所有的真核微生物中。miRNAs通常靶向一個(gè)或多個(gè) mRNA，通過(guò)與特定靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）互補(bǔ)性結(jié)合對(duì)其降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，存在于外周循環(huán)血中的miRNAs，作為一種調(diào)節(jié)因子，在血管發(fā)育、血管再生或心臟發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)大約800種的miRNAs，超過(guò)1000種mi RN

4、As能夠在人類基因組進(jìn)行表達(dá)。有研究提示 miRNAs可能與心臟病的治療與預(yù)防相關(guān)，可作為一種新型的生物標(biāo)記物，有望成為冠心病治療的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)與冠心病相關(guān)的miRNAs很多，其中研究較多的有 miR-1、miR-126、miR-133、miR-208和 miR-499等，這些 miRNAs在冠心病患者表達(dá)水平異常，提示它們可能是冠心病的潛在生物標(biāo)志物，但尚未得出一致結(jié)論。并且，此類 miRNAs在外周循環(huán)血中的表達(dá)水平與

5、冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度是否具有相關(guān)性尚不清楚。
　　本研究旨在探討外周循環(huán)血中 miR-133a、miR-208a和 miR-499a是否能夠在冠心病患者中進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)探討其與冠狀動(dòng)脈狹窄程度之間的關(guān)系，分析外周循環(huán)血中的miR-133a、miR-208a和 miR-499a在冠心病發(fā)病中的臨床預(yù)示作用，為進(jìn)一步探討冠心病的基因診斷和治療提供重要的理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.分析冠心病患者血漿 miRNA

6、-133a、miRNA-208a和 miRNA-499a表達(dá)水平與對(duì)照組之間的差異。
　　2.分析所有研究病例血漿 miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度的相關(guān)性，探討其在早期診斷和預(yù)防冠心病的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　1.獲得第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取得患者及家屬知情同意后，選取2014年12月至2015年5月于第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)

7、科住院并行冠狀動(dòng)脈造影（coronary angiography，CAG）明確診斷為冠心病患者290例作為病例組，年齡30～85周歲，他們之間無(wú)血緣關(guān)系，冠脈三支主要血管中，至少有一支狹窄程度超過(guò)50％。同時(shí)選取基線資料配對(duì)的110例疑診冠心病患者，行CAG后，冠狀動(dòng)脈三支主要血管的狹窄程度均小于50%，能夠明確排除冠心病，作為對(duì)照組。記錄所有研究對(duì)象的完整病史信息和收集所有研究對(duì)象采血所檢測(cè)的生化檢查的臨床資料。
　　2.Gen

8、si ni評(píng)分是評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的經(jīng)典評(píng)分方法，對(duì)400例入選對(duì)象按照四分位數(shù)間距分為四組：A組99例，Gensini評(píng)分≤22分，B組98例，Gensini評(píng)分23～55分，C組102例，Gensini評(píng)分56～96分，D組101例，Gensini評(píng)分≥97分。
　　3.所有研究對(duì)象的冠狀動(dòng)脈造影均采用橈動(dòng)脈或股動(dòng)脈途徑進(jìn)行。在行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)前抽取橈動(dòng)脈或股動(dòng)脈血5ml于含EDTA抗凝劑采血管中，兩次離心后取上清液，分

9、裝到EP管儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。
　　4.miRNA檢測(cè)：將離心得到的血漿取500μl到新的離心管中，用 RNAiso Plus（TaKaRa，Code No.9109），根據(jù)試劑操作說(shuō)明對(duì)樣本的總RNA進(jìn)行提取，放在-80℃低溫冰箱中保存，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。各樣本均取樣20ng，總RNA應(yīng)用PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，Code No.RR036A），配制成10μl體系的逆轉(zhuǎn)錄（revers

10、e transcription，RT）反應(yīng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到 cDNA。以 RNU6B為內(nèi)參。各樣本逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均取2μl應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，Code No.RR820A），配制成25μl體系的PCR反應(yīng)液，通過(guò)使用ABI7500儀以及對(duì)TaqMan探針的應(yīng)用，對(duì)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）進(jìn)行

11、實(shí)時(shí)定量，通過(guò)PCR雙重特異性引物擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)miR-133a、miR-208a和miR-499a的Ct值進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)參為RNU6B。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件 SPSS19.0計(jì)算各樣本的△Ct值（目的基因Ct值-內(nèi)參基因 Ct值），各樣本的相對(duì)定量2-△Ct。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）方法處理正態(tài)分布的臨床基線資料數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采取Mann-Whitney U檢驗(yàn)方法對(duì)偏態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異比較，通過(guò)頻數(shù)

12、以及百分?jǐn)?shù)表述分類資料。采取獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)比較兩組miRNA表達(dá)水平，采取卡方檢驗(yàn)對(duì)多組間進(jìn)行比較，采取Pearson相關(guān)分析對(duì)兩個(gè)變量之間的相關(guān)性進(jìn)行比較。以P＜0.05表示具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組比較，病例組吸煙患者比例更高，高密度脂蛋白水平更低，存在顯著差異（P＜0.05）。但其他因素如年齡、性別、體重、體重指數(shù)（BMI）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、空腹血糖、高血壓病史、低密度脂

13、蛋白（LDL）、糖尿病史、肌酐、尿酸水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　2.根據(jù)Gensi ni評(píng)分按照四分位數(shù)間距分為四組，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，各組甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）水平均存在顯著差異（P＜0.05）。而年齡、性別、體重、體重指數(shù)（BMI）、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史、空腹血糖、高密度脂蛋白（LDL）、肌酐、尿酸水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR相對(duì)定量

14、檢測(cè) miRNA結(jié)果：與對(duì)照組比較，病例組miRNA-133a、miRNA-208a和 miRNA-499a表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.根據(jù)Gensi ni評(píng)分按照四分位數(shù)間距分為四組，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，各組之間miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且表達(dá)水平變化與冠狀動(dòng)脈狹窄程度即Gensini評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)