微小RNA miR-141在胃癌發(fā)病中的作用.pdf

1、微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)約21-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，在動(dòng)植物中均有表達(dá)。miRNAs通常與靶mRNAs的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslatedregion，3’-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。miRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及遷移等重要的生物學(xué)過(guò)程。miRNAs表達(dá)和代謝的異常還與多種疾病，比如腫瘤密切相關(guān)。一些miRNAs在腫瘤組織中表達(dá)異常，

2、促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，其作用相當(dāng)于癌基因或抑癌基因。目前，已有證據(jù)提示miRNAs可應(yīng)用于腫瘤的基因診斷和治療。 應(yīng)用高通量的生物芯片技術(shù)，科學(xué)家已在多種人類(lèi)腫瘤，如肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌和前列腺癌等中篩選出表達(dá)異常的miRNAs。其中，Hsa-m1R-141(miR-141)作為miR-200家族的成員之一，在乳腺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞株和膽管癌細(xì)胞株中表達(dá)增高，而在前列腺癌、肝細(xì)胞肝癌和腎細(xì)胞癌中表達(dá)降低。異常表達(dá)的miR-

3、141參與了膽管癌細(xì)胞的增殖和腎癌細(xì)胞的侵襲活動(dòng)，提示miR-141與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。 胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，是男性腫瘤的第二死因，女性腫瘤的第三死因。2008年，美國(guó)新增的胃癌患者估計(jì)有21，500例，新增的胃癌死亡患者約10，880例。在中國(guó)每年新增約36-40萬(wàn)胃癌患者，死亡率占據(jù)我國(guó)腫瘤死因的第二位。但是，我們對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制尚缺乏全面和深入的了解。最近研究發(fā)現(xiàn)miR-106b-25簇、miR-21和miR

4、-27a在胃癌中的表達(dá)增加；同時(shí)，腸型胃癌和未分化型胃癌均有特征性的miRNAs表達(dá)譜，提示miRNAs與胃癌的發(fā)病機(jī)制有密切的聯(lián)系。 在本課題中，我們利用生物芯片技術(shù)篩選在胃癌組織和癌遠(yuǎn)端非腫瘤組織中差異表達(dá)的miRNAs，并通過(guò)定量Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)miR-141在胃癌患者腫瘤組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)狀態(tài)；同時(shí)采用現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)體外胃癌細(xì)胞模型研究miR-141在胃癌發(fā)病機(jī)制中的作用，為胃癌早期

5、診斷和尋求藥物靶點(diǎn)提供科學(xué)的依據(jù)。 1材料和方法： 1.1收集胃癌患者手術(shù)組織樣本，通過(guò)miRNAs芯片篩選在胃癌組織及癌遠(yuǎn)端非腫瘤組織中差異表達(dá)的miRNAs，并用定量Real-timePCR驗(yàn)證miR-141的表達(dá)情況。然后使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差檢驗(yàn)分析miR-141表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。 1.2使用定量Real-timePCR分析5株胃癌細(xì)胞株中miR-141的表達(dá)情況，結(jié)合細(xì)胞的增

6、殖和分化特征，篩選合適的胃癌細(xì)胞株。 1.3使用miR-141precursormolecule轉(zhuǎn)染方法在MGC-803胃癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)miR-141，通過(guò)相差顯微鏡觀察以及MTT檢測(cè)研究過(guò)量表達(dá)miR-141對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 1.4使用生物信息學(xué)方法(如miRanda，Pictar，Targetscan等)預(yù)測(cè)miR-141靶基因，結(jié)合既往文獻(xiàn)篩選與胃癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)的靶基因，并進(jìn)行初步驗(yàn)證。 2主要結(jié)果：

7、 2.1生物芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌遠(yuǎn)端非腫瘤組織相比，胃癌組織中的miR-141下調(diào)了大約12.0倍。使用定量Real-timePCR發(fā)現(xiàn)在80％的胃癌組織樣本中miR-141的表達(dá)水平下調(diào)，平均下降2.1倍(P＜0.01)。但miR-141的表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)性。 2.2篩選出來(lái)源于胃癌的MGC-803細(xì)胞株為合適的體外細(xì)胞模型。用miR-141precursor轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞中miR-1

8、41的表達(dá)上調(diào)了大約7×104倍；而pre-miRnegativecontrol轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在熒光顯微鏡下幾乎均顯示為紅色，提示miR-141precursor在MGC-803細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功且過(guò)量表達(dá)了miR-141。 2.3用相差顯微鏡和MTT法觀察miR-141precursor過(guò)量表達(dá)48小時(shí)和72小時(shí)后的MGC-803細(xì)胞。與pre-miRnegativecontrol轉(zhuǎn)染組相比，兩種方法均提示miR-141precurs

9、or轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖受到顯著抑制(48小時(shí)，P<0.05；72小時(shí)，P<0.01)。 2.4使用生物信息學(xué)方法分析，預(yù)選出miR-141的靶基因是FGFR2和ZEB2。但定量Real-timePCR檢測(cè)未顯示過(guò)量表達(dá)miR-141的MGC-803細(xì)胞內(nèi)FGFR2和ZEB2的mRNA水平有顯著改變。 3結(jié)論： 3.1基因芯片和定量Real-timePCR發(fā)現(xiàn)在胃癌患者的腫瘤組織中，miR-141的表達(dá)水平與癌遠(yuǎn)端非