厚莢相思（Acacia crassicarpa）試管苗玻璃化現(xiàn)象研究.pdf

1、本研究以厚莢相思(Acacia crassicarpa)成年樹材料葉片、莖尖、莖段及種子萌發(fā)苗為外植體，進行相思樹的離體培養(yǎng)與玻璃化研究，包括：①厚莢相思種子離體萌發(fā)條件的優(yōu)化：②厚莢相思葉片、莖尖和莖段離體再生體系的建立及玻璃化現(xiàn)象：③厚莢相思試管苗玻璃化影響因素的研究；④厚莢相思正常試管苗與玻璃化試管苗組織細胞學觀察及生理生化測定。主要研究結果如下： 1、厚莢相思離體再生體系建立及玻璃化現(xiàn)象 ①厚莢相思種子離體萌發(fā)條

2、件的優(yōu)化 采用先沸水浸泡20min再濃硫酸浸泡25min(不經過0.1％升汞消毒)處理厚莢相思種子，萌芽率高，污染率低，且沒有經過升汞處理，避免了升汞對種子的潛在危害。 ②厚莢相思成年樹葉片愈傷組織誘導及植株再生 以成年樹葉片為材料，比較了不同采集時間、激素、消毒時間對葉片培養(yǎng)的影響。試驗結果表明：愈傷組織的質量與材料采集時間有關，11月份采集的葉片出愈率高，所誘導的愈傷組織質量好，顏色淡黃疏松濕潤；高濃度的2,

3、4-D(1.0mg/L)配合高濃度的BA(1.0mg/L)所誘導的愈傷組織質量也較好，而在含有KT的培養(yǎng)基中，葉片愈傷組織誘導率低，愈傷組織質量較差；用0.1％升汞對葉片進行消毒，時間過長，葉片易被升汞殺死，消毒時間5或6min較好：0.1％升汞對成年樹葉片消毒6min，于1/2MS+1.0mg/LBA+1.0mg/L2.4-D中利于愈傷組織誘導，且產生再生植株。 ③厚莢相思成年樹莖尖、莖段培養(yǎng)及玻璃化現(xiàn)象 對于厚莢相思

4、成年樹莖段材料，流水沖洗時間2h效果較好，污染率低，萌芽率高；消毒時間長短影響莖尖、莖段芽的萌發(fā)，時間越長，抽芽率總體呈下降的趨勢。在成年樹莖段培養(yǎng)中普遍出現(xiàn)玻璃化苗，玻璃化率高達50％以上。 2、厚莢相思試管苗玻璃化的影響因素及克服措施 ①外植體對厚莢相思試管苗玻璃化的影響 試驗以試管苗外植體部位、長度為試驗因子，比較外植體對厚莢相思試管苗玻璃化的影響。研究結果表明：外植體部位對增殖系數(shù)及玻璃化率的作用不顯著，

5、外植體長度(大小)是影響厚莢相思增殖系數(shù)及玻璃化率的主要因素，材料越小，增殖系數(shù)越高，玻璃化率也越高。選擇長度0.8～1.0 cm的材料即有利于玻璃化率的降低，又保證了增殖系數(shù)的提高。 ②激素對厚莢相思試管苗玻璃化的影響 試驗結果表明：BA對厚莢相思試管苗增殖系數(shù)及玻璃化率的影響顯著，BA添加的適合濃度為1.0mg/L，KT適用的濃度范圍較廣，為0.01-4.0mg/L：生長素IAA、IBA和NAA對厚莢相思增殖系數(shù)及玻

6、璃化率的影響不明顯；添加0.1mg/L2，4-D或0.5mg/LGA卻有利于降低玻璃化率。 ③糖、凝固劑、AC對厚莢相思試管苗玻璃化的影響 試驗結果表明：高濃度的蔗糖有利于增殖系數(shù)的提高以及玻璃化率的降低：低濃度的凝固劑能促進增殖系數(shù)和玻璃化率的提高：添加AC可以起到壯苗生根的作用，且能顯著降低厚莢相思試管苗的玻璃化率，但過高．AC濃度會降低苗的生長勢，AC濃度應小于6g/L。 ④MS中的元素對厚莢相思試管苗玻璃

7、化的影響及培養(yǎng)基組合的優(yōu)化研究結果發(fā)現(xiàn)：MS中MgSO<,4>.7H<,2>O、KH<,2>PO<,4>、MnSO<,4>.4H<,2>O、煙酸、H<,3>BO<,3>、NH<,4>NO<,3>、甘氨酸有利于提高厚莢相思試管苗的增殖系數(shù)，MgSO<,4>.7H<,2>O、KH<,2>PO<,4>、甘氨酸、NH<,4>NO<,3>、VBI有利于厚莢相思試管苗不定芽的萌發(fā)，而NH<,4>NO<,3>、KNO<,3>、CaClv<,2>·2H

8、<,2>O、KH<,2>PO<,4>4種大量元素量過多，尤其是NH<,4>NO<,3>明顯過量，對玻璃化的影響大，促進了玻璃化苗的發(fā)生。且通過研究結果的比較，改良出3組適合提高增殖系數(shù)及降低玻璃化率的培養(yǎng)基組合，進一步與MS、1/2MS、B5研究比較，結果表明，B5與3組改良培養(yǎng)基組合均能起到提高增殖系數(shù)，顯著降低玻璃化率；不添加NH<,4>NO<,3>或減少MS中NH<,4>NO<,3>的量也能有效減少玻璃苗的發(fā)生。 ⑤培養(yǎng)條

9、件對厚莢相思試管苗玻璃化的影響 研究結果發(fā)現(xiàn)：容器與封口材料對厚莢相思玻璃化有影響，但影響不顯著：光照強度和pH值顯著影響厚莢相思的玻璃化，高光照強度及酸性條件有利于降低厚莢相思試管苗玻璃化率。 ⑥厚莢相思試管苗玻璃化的克服措施 根據(jù)上述研究結果，我們總結出克服厚莢相思試管苗玻璃化的綜合措施：(a)選用0.8～1.0cm外植體：(b)使用1.0mg.L<'-1>BA或0.01～4.0mg.L<'-1>KT，添加0

10、.01mg.L<'-1>2，4-D或0.5mg.L<'-1>IGA；(c)采用高濃度蔗糖(30.0mg.L<'-1>-50.0mg.L<'-1>)；(d)采用8.0mg.L<'-1>瓊脂條或卡拉膠；(e)添加AC(應小于6mg.L<'-1>)； (f)采用B5或改良培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，去除培養(yǎng)基中的NH<,4>NO<,3>或減少NH<,4>NO<,3>的量：(g)提高光照強度，pH值控制在．5.4左右。 3、厚莢相思試管苗玻

11、璃化發(fā)生的組織細胞學觀察 應用石蠟切片技術進行了厚莢相思正常苗與玻璃化苗的組織細胞學觀察。觀察表明：與正常苗葉片相比，玻璃化苗葉片的柵欄組織較少，柵欄組織及海綿組織排列不規(guī)則，細胞間隙大，維管束鞘排列疏松，細胞內含物少；正常苗莖段與玻璃苗莖段的顯微鏡觀察區(qū)別不明顯。 4、厚莢相思玻璃化試管苗的生理生化變化 進行了正常苗與不同程度玻璃化試管苗的生理生化測定。結果表明：玻璃化程度越高，苗的含水量就越高，水分飽和度越小

12、，實際上對水分的需求越?。翰ＡЩ缗c正常苗相比，蛋白質和葉綠素含量降低，DNA含量幾乎不變。而玻璃化程度越高，POD酶活性越高，而CAT酶活性則相反，葉綠素含量也越低，玻璃化苗葉綠素a與葉綠素b的比值高于正常苗。 總之，本研究摸索出了厚莢相思成年材料離體再生體系建立的關鍵因素；探索了厚莢相思玻璃化發(fā)生的影響因素，并提出了克服厚莢相思玻璃化的相應綜合措施，為厚莢相思的離體繁殖的產業(yè)化和商業(yè)化提供了有效的技術手段。同時，應用石蠟切片