豬卵巢組織玻璃化冷凍保存研究.pdf

1、卵巢組織的冷凍保存是在胚胎和卵母細(xì)胞冷凍保存的基礎(chǔ)上建立的又一種保護(hù)動(dòng)物遺傳資源的方法。利用簡(jiǎn)捷有效的玻璃化冷凍保存技術(shù)，可以對(duì)突然死亡的珍稀物種或稀有突變體動(dòng)物的卵巢予以及時(shí)的凍存，并在解凍后通過移植體外受精等技術(shù)獲得該物種。卵巢組織冷凍保存技術(shù)在保持生物多樣性方面具有重要意義，對(duì)胚胎工程學(xué)及生殖生物學(xué)的研究有著重要的意義。 本研究采用乙二醇(EG)和二甲基亞砜(DMSO)混合作為玻璃化冷凍保護(hù)劑，將豬卵巢組織經(jīng)過不同濃度的平

2、衡液中處理后進(jìn)行玻璃化冷凍保存，研究了不同的玻璃化冷凍法對(duì)豬卵巢冷凍保存后的組織學(xué)結(jié)構(gòu)、卵泡的影響；同時(shí)，對(duì)冷凍保存的豬卵巢解凍后卵母細(xì)胞的存活率、體外受精后的卵裂、胚胎發(fā)育狀況進(jìn)行了研究。研究的主旨在于探討卵巢組織玻璃化冷凍保存的方法和較理想的冷凍保護(hù)液，為瀕危物種的卵巢冷凍技術(shù)奠定有效的技術(shù)方法和數(shù)據(jù)支持。通過研究，結(jié)果如下： 1．玻璃化冷凍保存的豬卵巢組織形態(tài)學(xué)研究 比較不同玻璃化冷凍方法對(duì)豬卵巢組織形態(tài)的影響。結(jié)

3、果顯示，冷凍保護(hù)劑處理的豬卵巢皮質(zhì)部卵泡與新鮮卵巢皮質(zhì)部卵泡的結(jié)構(gòu)無明顯差異，卵母細(xì)胞保持圓形，周圍顆粒細(xì)胞形態(tài)正常；二步平衡組的卵巢組織切片中卵泡形狀正常，卵泡周圍的顆粒細(xì)胞完整、其周圍有較多的疏松的顆粒細(xì)胞，其外圍有較為致密的顆粒細(xì)胞，有少量卵母細(xì)胞體積變小，與周圍的顆粒細(xì)胞之間形成較大的空隙，部分組織塊的間質(zhì)組織比較疏松；一步平衡組有卵泡形態(tài)不規(guī)則，周圍的顆粒細(xì)胞排列松散甚至缺失，卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)萎縮，其周圍不見致密的顆粒細(xì)胞。E

4、G與DMSO混合作為玻璃化冷凍保護(hù)劑，兩步平衡玻璃化冷凍方法可用于豬卵巢組織的冷凍保存。 2. 玻璃化冷凍保存的豬卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的存活率檢測(cè) 玻璃化冷凍保存的卵巢解凍后的功能如何，取決于其內(nèi)分泌功能的恢復(fù)及卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的存活。本研究對(duì)不同方法玻璃化冷凍保存的豬卵巢組織內(nèi)卵母細(xì)胞，分別進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)卵母細(xì)胞的存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的存活率為94.087％，高于保護(hù)劑處理組卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的存活率74

5、.129％(P<0.05)，一步平衡冷凍組卵母細(xì)胞存活率為13.657％，二步平衡冷凍組卵母細(xì)胞的存活率為18.250％，兩組之間無顯著差異；冷凍保存的卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的存活率顯著低于對(duì)照組和處理組(P<0.05)；顯示，二步冷凍法玻璃化冷凍保存的卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的存活率高于一步平衡冷凍法。 3．玻璃化冷凍保存的豬卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的體外受精 卵母細(xì)胞的有效利用，在于其具有一定的發(fā)育能力，本研究在以上研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)玻璃化

6、冷凍保存的卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的體外受精能力及其胚胎發(fā)育狀況進(jìn)行了研究，結(jié)果證明，對(duì)照組、處理組與冷凍組之間的卵裂率差異顯著，對(duì)照組卵裂率明顯高于處理組，而處理組的卵裂率明顯高于兩個(gè)冷凍保存組。其中，二步平衡法冷凍保存組的卵裂率9.028％稍高于一步平衡法冷凍組的卵裂率3.403％，但是這兩個(gè)冷凍組都沒有得到囊胚，說明冷凍玻璃化冷凍保存對(duì)卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的發(fā)育能力有一定的影響。 以上結(jié)果顯示，使用EG與DMSO混合的玻璃化冷凍保護(hù)劑，經(jīng)