小鼠卵巢組織的玻璃化冷凍研究.pdf

1、目的：研究5.5EG(EthyleneGlycol，乙烯乙二醇)玻璃化冷凍卵巢組織的最佳預(yù)處理時(shí)間，比較5.5EG在不同的預(yù)處理時(shí)間下卵巢組織中卵母細(xì)胞的存活率以及卵巢組織的DNA的變化；比較玻璃化冷凍卵巢組織的最佳冷凍保護(hù)劑配方，比較卵巢組織經(jīng)EG5.5、EG+二甲基亞砜(Dimethylsuphoxide，DMSO)和EG+甘油(Glycerol，GC)三種玻璃化冷凍溶液凍融后卵母細(xì)胞的存活率；觀察卵巢組織中始基卵泡超微結(jié)構(gòu)的變化；

2、研究經(jīng)EG+DMSO玻璃化凍融的卵巢組織分離的GV期卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟后細(xì)胞骨架的變化，比較它與新鮮的MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體正常率。探討玻璃化冷凍的方法及其凍存小鼠卵巢組織的可行性。 方法：1.卵巢組織分別以5min、10min和15min暴露于1.5MEG磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)兩步脫水后直接投入液氮。玻璃化凍融的卵巢組織以新鮮卵巢組織為對照，觀察各組卵巢組織HE染色切片，比較各組之間卵泡的完整率；提取各組卵巢組織DNA進(jìn)行瓊脂糖

3、凝膠電泳，比較各組DNA變化的情況。 2.卵巢組織經(jīng)EG5.5、EG+DMSO(DMSO組)和EG+甘油(GC組)三種玻璃化冷凍溶液凍存，分離復(fù)蘇后的卵巢組織，使用碘化丙啶(PI)染色，比較各組卵母細(xì)胞的存活情況。 3.應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察玻璃化凍融的卵巢組織中始基卵泡超微結(jié)構(gòu)的變化；研究玻璃化凍融的卵巢組織分離的GV期卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟后細(xì)胞骨架的變化，比較它與新鮮的MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體正常率。 結(jié)果：1

4、.卵巢組織分別以5min、10min和15min暴露于1.5MEG磷酸鹽緩沖液，玻璃化凍融的卵巢組織HE染色切片的形態(tài)完整卵泡率分別為11.90％、31.82％和17.39％，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ(預(yù)處理5min)與對照組(34.78％)相比差異具有顯著性意義(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ(預(yù)處理10min)和Ⅲ(預(yù)處理15min)與對照組相比差異沒有顯著性意義(P＞0.05)；各組凍融的卵巢組織提取DNA，與對照組相比，DNA瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果沒有

5、明顯差別。 2.卵巢組織經(jīng)EG5.5、EG+DMSO(DMSO組)和EG+甘油(GC組)三種玻璃化冷凍溶液凍存，分離復(fù)蘇后的卵巢組織，三組卵母細(xì)胞的存活率分別為：26.5％、35.6％和26.1％，DMSO組高于EG5.5組和GC組，與兩組相比差異均具有顯著性意義(P＜0.05)。 3.觀察DMSO組玻璃化冷凍方案凍融的卵巢組織超微結(jié)構(gòu)，可見卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞及細(xì)胞間隙有空泡，線粒體腫脹，但始基卵泡的卵母細(xì)胞膜完整；通過

6、激光掃描共聚焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM)觀察玻璃化凍融的卵巢組織分離的GV期卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟后的紡錘體，可見形態(tài)正常的紡錘體(紡錘體呈對稱的桶型，且極性存在，染色體緊密排列在赤道板)、形態(tài)異常的微管、分布異常的染色體。實(shí)驗(yàn)組紡錘體正常率為35.0％，與新鮮的MⅡ期卵母細(xì)胞(紡錘體正常率為75.0％)相比差異具有顯著性意義(P＜0.05)。 結(jié)論：在本研究采用的冷凍條件(