Obestatin對(duì)心力衰竭大鼠腎臟水通道蛋白2短時(shí)調(diào)控作用的研究.pdf

1、心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段，是現(xiàn)代社會(huì)主要的致死原因之一。水潴留是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制，機(jī)體內(nèi)多種因素參與了水潴留的形成與發(fā)展，其中腎臟集合管主細(xì)胞分布的腎臟水通道蛋白2(Aquaporin2，AQP2)在管腔側(cè)質(zhì)膜分布增加是水潴留形成關(guān)鍵性的一環(huán)。AQP2分布于腎臟集合管主細(xì)胞管腔側(cè)質(zhì)膜和胞質(zhì)內(nèi)囊泡，其在包括精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)、降鈣素(calcitonin)、一氧化氮

2、(NO)等在內(nèi)的多種因素調(diào)節(jié)下而改變其在質(zhì)膜及囊泡內(nèi)的分布比例，被稱(chēng)為AQP2的短時(shí)調(diào)控。
　　Obestatin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種由23個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，GPR39是其可能的受體。以往對(duì)其研究主要集中在胃腸道功能以及能量代謝等方面，近幾年來(lái)心血管領(lǐng)域也逐漸進(jìn)入了Obestatin的研究中，目前已發(fā)現(xiàn)其對(duì)血壓調(diào)節(jié)、內(nèi)皮損傷以及再灌注損傷等方面具有調(diào)控作用，但對(duì)心力衰竭領(lǐng)域仍少有研究。前期研究顯示心衰患者，尤其心腎綜合征患者血

3、漿內(nèi)Obestatin表達(dá)升高。另外有研究顯示Obestatin在中樞可抑制口渴，減少飲水進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡，但對(duì)于Obestatin在外周對(duì)于水平衡的作用尚不明確。結(jié)合GPR39在腎臟的表達(dá)以及Obestatin在骨骼肌細(xì)胞中自分泌/旁分泌方式的修復(fù)作用，我們推測(cè)心力衰竭時(shí)Obestatin通過(guò)內(nèi)分泌及自分泌/旁分泌的方式調(diào)節(jié)AQP2在集合管細(xì)胞管腔側(cè)質(zhì)膜的分布比例，進(jìn)而調(diào)節(jié)腎臟對(duì)水的重吸收，參與心衰水潴留的發(fā)生發(fā)展。
　　我們

4、通過(guò)構(gòu)建大鼠心力衰竭模型，檢測(cè)心衰大鼠循環(huán)血漿及腎臟組織表達(dá)Obestatin的變化，在此基礎(chǔ)上，在集合管細(xì)胞觀察Obestatin對(duì)AQP2的亞細(xì)胞分布及蛋白總量及磷酸化水平的影響以明確Obestatin對(duì)AQP2的短時(shí)調(diào)控作用，并探討其可能的機(jī)制。
　　第一部分 Obestatin在心梗后心衰大鼠循環(huán)及腎臟的表達(dá)
　　目的:研究心力衰竭大鼠循環(huán)及腎臟組織中Obestatin的表達(dá)及其可能的生物學(xué)意義。
　　方法:采

5、用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎方法制備大鼠心肌梗死后心衰模型，成功構(gòu)建心衰大鼠6只;另5只大鼠只開(kāi)胸不結(jié)扎為假手術(shù)組;5只大鼠作為正常組，分別收集術(shù)前及術(shù)后8周尿量及飲水量;采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血漿Obestatin濃度，取大鼠腎臟組織行免疫組織化學(xué)檢測(cè)Obestatin在腎臟的表達(dá)并分析累積光密度值比較各組表達(dá)差異，同時(shí)以Western Blot方法對(duì)各組腎臟組織表達(dá)的Obestatin進(jìn)行半定量分析。
　　結(jié)果:心衰組大鼠水潴留量與正常

6、組及假手術(shù)組相比明顯增多（22.00±5.44ml vs5.80±2.59ml，P＜0.01;22.00±5.44ml vs3.00±4.69ml，P＜0.01）;免疫組化結(jié)果顯示Obestatin在大鼠腎臟腎小管及集合管表達(dá)，分析光密度值及Western Blot結(jié)果顯示心衰組大鼠腎臟組織Obestatin表達(dá)較正常組及假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:Obestatin在心力衰竭大鼠循環(huán)及腎臟表達(dá)增高，可能以?xún)?nèi)分泌

7、及自分泌或旁分泌形式參與心衰水潴留的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分 Obestatin對(duì)腎臟水通道蛋白2的短時(shí)調(diào)控作用
　　目的:探究Obestatin對(duì)小鼠腎臟內(nèi)髓集合管3上皮細(xì)胞(IMCD3) AQP2的短時(shí)調(diào)控作用并進(jìn)一步探索其可能的機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)IMCD3，分別給予PBS、不同濃度的Obestatin（10-7mmol/L、10-6mmol/L）、 NA-Obestatin(10-7mmol/L)、 dDAV

8、P(10-7mmol/L)及OPC-31260(10-7mmol/L)干預(yù)15min、30min、60min，激光共聚焦觀察IMCD3細(xì)胞AQP2的分布定位，Western Blot法檢測(cè)AQP2及P-AQP2(Ser256)的表達(dá)水平，并分析P-AQP2(Ser256)占AQP2的比例。
　　結(jié)果:1、10-7mmol/L Obestatin及10-6mmol/L Obestatin干預(yù)15min后激光共聚焦觀察與對(duì)照組(PBS

9、)相比均未見(jiàn)AQP2分布改變，作用30min及60min后與對(duì)照組相比，可見(jiàn)AQP2在細(xì)胞膜分布減少;10-7mmol/L NA-Obestatin作用15min、30min、60min均未見(jiàn)AQP2分布改變;10-7mmol/L dDAVP作用30min后與對(duì)照組相比AQP2在細(xì)胞膜分布增多，作用15min及60min時(shí)未見(jiàn)其分布改變;10-7mmol/L OPC-31260作用15min時(shí)與對(duì)照組相比AQP2分布未見(jiàn)改變，30min

10、及60min后與對(duì)照組相比，可見(jiàn)AQP2在細(xì)胞膜分布減少。2、Western Blot檢測(cè)蛋白水平可見(jiàn)干預(yù)15min后不同濃度Obestatin（10-7mmol/L、10-6mmol/L）組、NA-Obestatin組、dDAVP組及OPC-31260組AQP2表達(dá)水平與對(duì)照組相比均未見(jiàn)明顯改變;dDAVP組P-AQP2(Ser256)及磷酸化比值較對(duì)照組升高（均P＜0.05），Obestatin、NA-Obestatin及OPC-3

11、1260組均未見(jiàn)明顯變化。干預(yù)30min后，OPC-31260組AQP2及P-AQP2(Ser256)表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯降低（均P＜0.05），磷酸化比值升高(P＜0.05)，余各組AQP2、P-AQP2(Ser256)及磷酸化比值均未見(jiàn)明顯變化。干預(yù)60min后，不同濃度Obestatin組、dDAVP組及OPC-31260組AQP2表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯下降（均P＜0.05），NA-Obestatin組未見(jiàn)改變;不同濃度O