Gsα基因干擾對心力衰竭幼鼠心肌鈣調(diào)控蛋白的作用研究.pdf

1、研究背景:正常情況下,交感神經(jīng)遞質(zhì)激活β-腎上腺素能受體(p-adrenoreceptor,β-AR)后,后者與Gs蛋白結(jié)合,Gs蛋白異源三聚體a、βγ解離,Gsa活化,β-AR-Gs蛋白-cAMP信號通路激活,引起L型Ca2+離子通道(L-type Ca2+channel,LTCC)、受磷蛋白(phospholamban,PLB)、蘭尼堿受體(ryanodine receptor2,RyR2)、肌鈣蛋白(cTnI)等磷酸化,并通過與其

2、附屬蛋白相互作用,如FK506結(jié)合蛋白(FK506 binding protein,FKBP12.6)、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum.Ca2+ATPase,SERCA2a)等,調(diào)控鈣的攝取與釋放,誘發(fā)心肌興奮收縮耦聯(lián)?？梢?Gsa作為該信號通路上游的關(guān)鍵偶聯(lián)因子,其量和活性在維持正常心功能狀態(tài)中具有重要意義。
　　 慢性心力衰竭(haeart failure,HF)時,交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素

3、-血管緊張素系統(tǒng)等活性增高,Gsa蛋白活性和(或)含量下降,β-AR.信號通路下調(diào),這些改變究竟是引起心功能惡化的始動因素,還是一種適應性的保護機制,目前仍未完全明了。因心衰時其下游的鈣調(diào)控蛋白的量、活性與結(jié)構(gòu)亦出現(xiàn)相應變化,鑒于鈣離子穩(wěn)態(tài)對維持心肌細胞正重慶市自然科學基金課題(編號:CSTC.2007BB5301)常功能至關(guān)重要,鈣離子的轉(zhuǎn)運調(diào)控異常,可導致心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)功能障礙,進而影響收縮一舒張功能,并可誘發(fā)嚴重心律失常,因

4、此探索心衰時Gsa變化對鈣調(diào)控蛋白和心功能的影響具有重要理論和臨床價值。其次目前對心衰時這一信號通路的研究所用實驗動物多為成年動物,至于在幼年動物體內(nèi)是否具有不同的表現(xiàn)目前仍不清楚。本實驗擬通過構(gòu)建Gsa蛋白基因干擾的慢性心衰幼鼠模型,探討Gsa蛋白變化對心衰幼鼠心肌鈣調(diào)控蛋白RyR2、FKBP12.6、PLB、SERCA2a的影響,探討Gsa變化在心衰發(fā)生發(fā)展中的意義。實驗共分三部分:
　　 第一部分靶向大鼠gnas基因shR

5、NA真核表達載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:構(gòu)建并鑒定靶向大鼠gnas基因的短發(fā)夾RNA(short hairpinRNA,shRNA)真核表達載體。
　　 方法:根據(jù)大鼠gnas基因mRNA序列設計并合成3條shRNA,退火形成雙鏈后克隆進入線性化pGenesil-1.1載體,并進行酶切鑒定和測序,鑒定構(gòu)建成功后進行后續(xù)的體外和體內(nèi)實驗。
　　 結(jié)果:經(jīng)酶切和測序鑒定分析,構(gòu)建的shRNA已成功插入載體,并且與設

6、計序列完全相符。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了shRNA表達質(zhì)粒載體pgnas-shRNA1、pgnas-shRNA2和pgnas-shRNA3,擴增和純化獲得理想的質(zhì)粒產(chǎn)品,為后續(xù)研究Gsa蛋白在心衰中的作用奠定了實驗基礎。
　　 第二部分RNAi選擇性下調(diào)大鼠心肌細胞Gsα蛋白的體外實驗
　　 目的:用RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi),選擇性下調(diào)大鼠心肌細胞上Gsa蛋白的表達,篩選出抑制

7、Gsa蛋白效果最明顯的shRNA表達質(zhì)粒。
　　 方法:將上述三種構(gòu)建成功的RNA干擾質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒,通過脂質(zhì)體LipofectamineTM LTX&PLUS轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞,并設空白對照組,轉(zhuǎn)染后通過半定量RT-PCR和Western-blot法檢測Gsa mRNA和蛋白的表達情況,以內(nèi)參照三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)進行標化。
　　 結(jié)果:通過LipofectamineTM LTX&PLUS進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)

8、染,細胞毒性作用相對較小。shRNA1-3均使Gsot的mRNA和蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),且shRNA3的抑制效果最顯著,陰性對照質(zhì)粒組與空白對照組Gsa表達差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:利用RNAi技術(shù)成功下調(diào)了原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中Gsa,的表達,篩選出沉默效果最明顯的shRNA3真核表達質(zhì)粒,為下一步體內(nèi)實驗奠定了基礎。
　　 第三部分 Gsa基因干擾對心力衰竭幼鼠心肌鈣調(diào)節(jié)蛋白的作

9、用
　　 目的:構(gòu)建Gsa蛋白基因干擾的慢性心衰幼鼠模型,闡明Gsa蛋白變化對心衰幼鼠心肌鈣調(diào)控蛋白RyR2、FKBP12.6、PLB、SERCA2a的影響,探討Gsa變化在心衰發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　 方法:健康雄性4周齡Wistar幼鼠,隨機分三組,彩色超聲心動圖測定后,(1)Gsa基因干擾心衰組(n=13),通過經(jīng)腹心包腔內(nèi)注射術(shù)將上述體外實驗所篩選出來的基因沉默效果較好的質(zhì)粒pgnas-shRNA3混合液,注入心

10、包腔,并進一步通過腹主動脈和下腔靜脈造瘺法構(gòu)建慢性心衰模型,(2)正常鼠構(gòu)建的心衰模型組(n-11),心包腔注射等量無菌PBS,并進一步通過腹主動脈和下腔靜脈造瘺法構(gòu)建慢性心衰模型,3)假手術(shù)組(n=9),心包腔注射等量的無菌PBS,只穿刺腹主動脈不與下腔靜脈間造瘺。8周后復查超聲心動圖,然后,麻醉取心臟標本,進行組織病理學檢查,RT-PCR、Western-blot檢測心肌鈣調(diào)控蛋白表達。
　　 結(jié)果v8周后彩色多普勒超聲心動

11、圖對三組進行相關(guān)測定,與假手術(shù)組相比,兩心衰組的多項心功能指標均有不同程度的下降,RyR2、FKBP12.6、SERCA2a表達降低,SERCA2a活性降低。Gsa基因干擾心衰組與正常鼠構(gòu)建的心衰組相比,基因干擾心衰組的左室收縮末期容積(Left ventricular end-systolic volume,LVESV)下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),左室射血分數(shù)(Left ventricular ejection fract

12、ion,LVEF)、左室短軸縮短率(Left ventricular fraction shortening,LVFS)升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),左室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular internaldimension diastole,LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular internaldimension systole,LVIDs)、左室舒張末期容積(Left ventric

13、ularend-diastolic volume,LVEDV)略有降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；心肌鈣調(diào)控蛋白RyR2、FKBP12.6表達升高,且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),兩者比值也升高；PLB基因與蛋白表達在各組間無顯著差異(P＞0.05),Gsa基因干擾心衰組與正常鼠構(gòu)建的心衰組比,SERCA2a含量、活性增高,并具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01、P＜0.05),SERCA2a與PLB比值亦升高。
　　 結(jié)論: