槐定堿對大鼠慢性心力衰竭干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　 槐定堿(Sophoridine)是從豆科槐屬植物苦豆子Sophora alopecuroides L中分離的單體生物堿，近年來發(fā)現(xiàn)槐定堿在抗心律失常和增強心肌收縮力方面有重要的藥理作用和應(yīng)用前景，本實驗以慢性心衰大鼠作為模型，以槐定堿作為干預(yù)劑，從細(xì)胞、分子和超微結(jié)構(gòu)水平，對慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞異常鈣循環(huán)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為槐定堿的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)性實驗資料。
　　 方法：
　　 (1)實驗分組：

2、將SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為假手術(shù)組，心力衰竭組，槐定堿低、中、高(5、10、20mg/kg)劑量組；
　　 (2)心衰模型制備：心力衰竭組和藥物干預(yù)組大鼠均行冠狀動脈左前降支永久性結(jié)扎，假手術(shù)組除只穿線不結(jié)扎冠脈外，其余步驟相同。4周后檢測各組大鼠心衰模型相關(guān)指標(biāo)；
　　 (3)心肌細(xì)胞L-型鈣電流(ICa·L)、胞漿內(nèi)鈣瞬變和肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量的測定：酶解法分離心肌細(xì)胞，F(xiàn)luo-3/AM負(fù)載心肌細(xì)胞，采用

3、全細(xì)胞膜片鉗-激光掃描共聚焦顯微鏡聯(lián)機(jī)技術(shù)同步記錄各組大鼠心肌細(xì)胞ICa·L和胞漿內(nèi)鈣瞬變；利用Fluo-5N/AM負(fù)載心肌細(xì)胞，直接記錄肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量；
　　 (4)鈣調(diào)控相關(guān)蛋白分子生物學(xué)檢測：采用Western-blot方法測定鈣調(diào)控相關(guān)蛋白SERCA2a、PLB、NCX表達(dá)水平，并進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量分析；
　　 (5)超微結(jié)構(gòu)觀察：各組大鼠心肌按照常規(guī)透射電鏡樣品制備技術(shù)制樣后，透射電鏡下觀察，拍照記錄超微結(jié)構(gòu)。

4、
　　 (6)統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。全部計量資料數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。各組之間差異顯著性判別先進(jìn)行方差分析(ANOVA)，如差異顯著，則進(jìn)一步用LSD法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 (1)槐定堿對慢性心衰大鼠心重指數(shù)及心功能的影響：與假手術(shù)組相比，心力衰竭組心重指數(shù)(HW/BW)和左心室舒張末壓(LVEDP)升高，左室內(nèi)壓最大上升

5、速率(+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)降低(P<0.01)；與心力衰竭組相比，槐定堿中、高劑鼉組的HW/BW和LVEDP降低(P<0.01)，+dp/dtmax和-dp/dtmax升高(P<0.01)，槐定堿低劑量組的+dp/dtmax明顯升高(P<0.01)，-dp/dtmax變化不明顯(P>0.05)。
　　 (2)槐定堿對心肌細(xì)胞L-型鈣電流(ICa·L)的影響：心力衰竭組大鼠的ICa·L低

6、于假手術(shù)組；槐定堿低劑量組、中劑量和高劑量組心肌細(xì)胞的ICa·L較心力衰竭組均明顯增大。
　　 (3)槐定堿對各組大鼠心肌細(xì)胞鈣誘導(dǎo)鈣釋放(CICR)的影響：CICR過程中的鈣火花發(fā)生率心力衰竭組明顯低于假手術(shù)組，且鈣瞬變峰值(△F/F0)心力衰竭組(17.05±1.25，n=12個細(xì)胞)明顯低于假手術(shù)組(49.64±2.68，n=12個細(xì)胞，P<0.01)；槐定堿低劑量組的鈣火花發(fā)生率較心力衰竭組增加，鈣瞬變峰值(18.96±

7、1.01，n=12個細(xì)胞)高于心力衰竭組(17.05±1.25，n=12個細(xì)胞，P<0.05)；槐定堿中、高劑量組的鈣火花發(fā)生率較心力衰竭組明顯增加，且鈣瞬變峰值中劑量(45.79±2.52，n=12個細(xì)胞)和高劑量組(47.21±2.07，n=12個細(xì)胞)明顯高于心力衰竭組(17.05±1.25，n=12個細(xì)胞，P<0.01)。
　　 (4)槐定堿對各組大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)(SR)鈣容量的影響：心力衰竭組大鼠心肌細(xì)胞Fluo-5

8、N/AM染色后熒光強度顯著低于假手術(shù)組心肌細(xì)胞Fluo-5N/AM染色后的熒光強度；且熒光強度變化的平均值(△F/F0)心力衰竭組(21.4±2.54，n=12個細(xì)胞)亦明顯低于假手術(shù)組(56.4±3.01，n=12個細(xì)胞，P<0.01)；槐定堿低劑量組大鼠心肌細(xì)胞Fluo-5N/AM染色后熒光強度比心力衰竭組增大，熒光強度變化的平均值(△F/F0)(31.1±2.93，n=12個細(xì)胞)高于心力衰竭組(21.4±2.54，n=12個細(xì)胞

9、，P<0.01)；槐定堿中、高劑量組心肌細(xì)胞Fluo-5N/AM染色后的熒光強度較心力衰竭組均明顯增大，熒光強度變化的平均值(△F/F0)中劑量組(53.8±3.38，n=12個細(xì)胞)和高劑量組(56.2±3.28，n=12個細(xì)胞)無明顯差異，兩者均明顯高于心力衰竭組(21.4±2.54，n=12個細(xì)胞，P<0.01)。
　　 (5)鈣調(diào)控相關(guān)蛋白分子生物學(xué)結(jié)果顯示：
　　 ①與假手術(shù)組相比，心衰組SERCA2a的表達(dá)量

10、下降；半定量分析結(jié)果顯示：心衰組SERCA2a/GAPDH(0.041±0.003，n=6)顯著低于假手術(shù)組(0.25±0.02，n=6，P<0.01)；與心衰組相比，槐定堿中劑量組(0.082±0.006，n=6)和高劑量組(0.074±0.005，n=6)明顯高于心衰組(0.041±0.003，n=6，P<0.01)；槐定堿低劑量組(0.042±0.002，n=6)與心衰組相比無明顯差異。
　　 ②與假手術(shù)組相比，心衰組PL

11、B的表達(dá)量無明顯區(qū)別；半定量分析結(jié)果顯示：心衰組PLB/GAPDH(0.63±0.03，n=6)與假手術(shù)組(0.66±0.03，n=6)相比無顯著差異；槐定堿低劑量組PLB/GAPDH(0.58±0.05，n=6)、中劑量組(0.63±0.02，n=6)和高劑量組(0.63±0.06，n=6)與心衰組相比均無明顯差異。
　　 ③與假手術(shù)組相比，心衰組NCX的表達(dá)量無明顯區(qū)別；半定量分析顯示：心衰組NCX/GAPDH(0.099±

12、0.004，n=6)與假手術(shù)組(0.099±0.005，n=6)相比無顯著差異；與心衰組相比，槐定堿低劑量組(0.083±0.003，n=6)明顯低于心衰組(0.099±0.004，n=6，P<0.01)；槐定堿高劑量組(0.116±0.009，n=6)明顯高于心衰組(0.099±0.004，n=6，P<0.01)；槐定堿中劑量組(0.093±0.004，n=6)與心衰組相比無明顯差異。
　　 ④與假手術(shù)組相比，心衰組的PLB/

13、SERCA2a(15.13±0.94，n=6)較假手術(shù)組(2.66±0.20,n=6)明顯增大(P<0.01)；與心力衰竭組相比，槐定堿低劑量組(13.85±1.88，n=6)減小(P<0.05)，槐定堿中劑量(7.69±0.48，n=6)和高劑量組(8.57±0.87，n=6)均顯著低于心衰組(P<0.01)。
　　 ⑤與假手術(shù)組相比，心衰組的NCX/SERCA2a(2.40±0.23，n=6)較假手術(shù)組(0.40±0.03，

14、n=6)明顯增大(P<0.01)；與心力衰竭組相比，槐定堿低劑量(1.98±0.12，n=6)、中劑量(1.14±0.04，n=6)和高劑量組(1.58±0.19，n=6)均明顯降低(P<0.01)。
　　 (6)槐定堿對各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響：假手術(shù)組大鼠心肌肌絲排列整齊，線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)清楚。心力衰竭組大鼠心肌出現(xiàn)肌絲斷裂溶解現(xiàn)象，大多數(shù)肌絲排列松散且發(fā)生錯位，部分線粒體的嵴結(jié)構(gòu)模糊不清，且出現(xiàn)溶解現(xiàn)象?；倍▔A低劑