金黃色葡萄球菌ArtR的功能研究及RANⅢ結(jié)合蛋白的鑒定.pdf

1、金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽性條件致病菌，在環(huán)境中分布廣泛。近年來，金黃色葡萄球菌已成為主要的臨床感染菌，醫(yī)院內(nèi)每年都會有數(shù)以百萬的金黃色葡萄球菌感染發(fā)生。金黃色葡萄球菌感染能夠引發(fā)的癥狀有食物中毒、潰瘍、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等，甚至引起敗血性休克而導致死亡。金黃色葡萄球菌之所以能引起如此多的病癥，是因為它能分泌多種致病因子，其中α溶血素是非常重要的毒素之一。在感染過程中，這些毒性因子受到了廣泛而精細的調(diào)控，從而幫助細菌響應和適應各

2、種復雜的環(huán)境。這些調(diào)控因子包括二元信號系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和非編碼RNA等。
　　我們在前期研究LuxS/AI-2信號系統(tǒng)時，發(fā)現(xiàn)了一個與luxS反向重復的sRNA。Northern blot和RACE分析證實，這個sRNA全長為345nt，并將其命名為ArtR。序列分析和RT-PCR等實驗表明，ArtR是金黃色葡萄球菌中所特有的一種sRNA，它的表達受到Agr群體感應系統(tǒng)的抑制。但是這種抑制效應不是通過Agr群體感應系統(tǒng)常用的RN

3、AⅢ來實現(xiàn)，而是直接通過AgrA蛋白與ArtR的啟動子相互作用來實現(xiàn)?；蚯贸龑嶒灠l(fā)現(xiàn)，ArtR的缺失影響了金黃色葡萄球菌α溶血素的水平。而凝膠阻滯分析實驗證明，ArtR并不能直接結(jié)合α溶血素的mRNA。于是我們尋找了α溶血素相關的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)ArtR突變株中α溶血素的抑制因子SarT的水平有所升高。通過凝膠阻滯分析和RNA酶解等實驗我們證實ArtR通過與sarT5'UTR上的一段區(qū)域與相互作用，促進了RNaseⅢ對sarT mRNA

4、的降解。這項研究鑒定了金黃色葡萄球菌屬中一個新的毒性相關的sRNA，并且闡明它是通過與轉(zhuǎn)錄因子mRNA相互作用來實現(xiàn)其調(diào)控過程的。
　　sRNA調(diào)控不僅局限于sRNA與靶RNA的相互作用，可能有很多蛋白質(zhì)參與其中。但是由于技術的限制，對金黃色葡萄球菌中sRNA相關的蛋白質(zhì)知之甚少。我們通過前期的研究工作成功建立了利用tRNA融合RNA適配體(簡稱tRSA)進行sRNA蛋白質(zhì)pull-down的實驗體系，選取了金黃色葡萄球菌中重要的

5、sRNA——RNAⅢ，對其結(jié)合蛋白進行釣取。實驗發(fā)現(xiàn)tRSA標記的RNA能夠較好被鏈霉親和素磁珠捕獲，用這個體系成功釣取了81個能夠結(jié)合RNAⅢ的候選蛋白質(zhì)。我們進一步通過蛋白質(zhì)表達、凝膠阻滯分析驗證了這些候選蛋白與RNAⅢ的結(jié)合能力。選取的9個蛋白質(zhì)中，RNaseⅢ對RNAⅢ具有降解活性，7個蛋白（CshA、RNase J2、Era、Hu、WalR、Pyk、FtsZ）可以結(jié)合RNAⅢ，PfkA沒有檢測出結(jié)合能力。同時選取了兩個pull