金黃色葡萄球菌外排蛋白QacA的優(yōu)化表達(dá)研究.pdf

1、目的：不同菌種對(duì)密碼子的偏好是影響重組蛋白表達(dá)的主要因素之一，本研究即是通過優(yōu)化密碼子的使用提高金黃色葡萄球菌主動(dòng)外排基因qacA在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
　　方法：以重組質(zhì)粒pBluescriptⅡ SK(+)/qacA為模板，通過PCR方法擴(kuò)增出帶有AatⅡ和NheⅠ酶切位點(diǎn)的qacA基因，經(jīng)酶切、純化后用T4連接酶將其與同樣酶切過的pET-cocol載體連接；同時(shí)根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子，設(shè)計(jì)并合成密碼子優(yōu)化的qacA基因(o

2、qacA)，將合成的基因插入到pET-cocol載體中。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-cocol/qacA及密碼子優(yōu)化的pET-cocol/oqacA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析表達(dá)情況，Western Blotting試驗(yàn)鑒定表達(dá)蛋白。最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定攜帶pET-cocol/oqacA菌株對(duì)消毒劑的耐受性。
　　結(jié)果：(1).酶切鑒定證實(shí)qacA基因及oqacA基因已與原核表達(dá)載體pET-

3、cocol連接，重組表達(dá)質(zhì)粒pET-cocol/qacA及密碼子優(yōu)化的pET-cocol/oqacA已構(gòu)建成功;(2).重組質(zhì)粒pET-cocol/qacA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功地表達(dá)了QacA蛋白，其分子量約為55千道爾頓；優(yōu)化后重組質(zhì)粒pET-cocol/oqacA在大腸桿菌中高效表達(dá)；(3).Western Blotting試驗(yàn)顯示QacA表達(dá)蛋白與合成的特異性QacA一抗呈特異性免疫反應(yīng)；(4)MIC