金黃色葡萄球菌agrC結(jié)合小肽的篩選及其功能研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是目前下呼吸道感染常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性球菌，其致病機(jī)制與其能分泌多種胞外酶和外毒素有關(guān)，它可以引起多個(gè)器官組織感染，并有較高的發(fā)病率和死亡率[1，2]。近年來(lái)，由于其感染率的上升、產(chǎn)生耐藥速度的加快以及其易于從急性感染向慢性、持久性、復(fù)發(fā)性感染轉(zhuǎn)變等特點(diǎn)，金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的感染逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。其附屬基因調(diào)節(jié)子(accessory gene regulator，agr)是一種

2、重要的密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)信號(hào)系統(tǒng)和毒力因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與金黃色葡萄球菌生物膜(biofilm，BF)的形成與分散(dispersion)以及毒力因子(virulence factor)的表達(dá)調(diào)控[3-5]。許多研究表明金葡菌agr系統(tǒng)是在毒力因子調(diào)節(jié)過(guò)程中起中心作用的密度感應(yīng)系統(tǒng)。 AgrC是金葡菌二元信號(hào)系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，它是一個(gè)受體組氨酸蛋白激酶，包含一個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的組氨酸蛋

3、白激酶域，能夠被同源或非同源自誘導(dǎo)肽(autoinducing peptides，AIPs)激活或抑制[6，7]。AgrC屬于比較罕見(jiàn)的組氨酸蛋白激酶亞科，包括5-6個(gè)跨膜片段。AgrC通過(guò)對(duì)AIP的特異識(shí)別，激活蛋白激酶胞內(nèi)域部分活性，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄操縱子RNAII和RNAIII的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控agr系統(tǒng)，在agr調(diào)節(jié)系統(tǒng)中對(duì)毒力調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用[8]。 由于抗生素的廣泛使用，使多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生了抗藥性，因此，應(yīng)用傳統(tǒng)的篩選方法獲得具有

4、新型抗菌機(jī)制的抗生素越來(lái)越困難。研究發(fā)現(xiàn)一些群體感應(yīng)信號(hào)分子類似物能夠抑制致病因子的生成或葡萄球菌的生長(zhǎng)[9，10]，因此通過(guò)干擾QS系統(tǒng)而減少金黃色葡萄球菌毒素、致病因子表達(dá)及生物膜形成，已成為預(yù)防和治療金葡菌感染的新的突破口，為解決傳統(tǒng)抗生素耐藥問(wèn)題提供了新的靶點(diǎn)[11，12]。因此，發(fā)現(xiàn)可以與agrC特異性結(jié)合的短肽，阻斷agr系統(tǒng)活化，以agrC作為治療金葡菌感染的靶分子，從而減輕或抑制金葡菌毒力因子產(chǎn)生，達(dá)到控制金葡菌感染的目

5、的具有重要意義。 近年來(lái)，以噬菌體展示(phage display)技術(shù)篩選肽類藥物的蓬勃發(fā)展為金葡菌感染的防治提供了新的思路。噬菌體展示技術(shù)的原理是將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在噬菌體表面，而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該噬菌體內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子的多肽配體通過(guò)淘洗(panning)得以快速鑒定。 本實(shí)驗(yàn)擬利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)，

6、篩選可與agrC特異結(jié)合的小分子多肽，并研究它們對(duì)金葡菌毒力和生物膜形成能力的影響。 研究方法： 1、構(gòu)建金黃色葡萄球菌N315標(biāo)準(zhǔn)株agrC的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-agrC，經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE鑒定agrC融合蛋白的表達(dá)，磁珠分選純化法獲得純化的agrC蛋白。 2、采用經(jīng)典的親和富集法對(duì)噬菌體12肽庫(kù)進(jìn)行4輪親和篩選，以agrC為靶分子，經(jīng)過(guò)4輪篩選，獲得可與ag

7、rC特異性結(jié)合的陽(yáng)性噬菌體克隆。ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證。 3、通過(guò)ELISA法對(duì)篩選出來(lái)的克隆進(jìn)行鑒定，獲得能與agrC特異性結(jié)合的陽(yáng)性噬菌體克隆，將獲得的陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，根據(jù)噬菌體克隆基因所插入的外源DNA序列推導(dǎo)出呈現(xiàn)的外源多肽氨基酸序列。應(yīng)用Blast軟件將多肽序列與agrC的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行比較分析。 4、檢測(cè)陽(yáng)性克隆噬菌體與agrC的親和力及其劑量依賴性，篩選出親和力最高的陽(yáng)性克隆噬菌體。

8、 5、人工合成篩選得到agrC結(jié)合多肽，觀察其對(duì)金葡菌生物膜形成能力的影響及其對(duì)生物膜形成相關(guān)基因和毒素分泌的影響。 研究結(jié)果： 1、重組克隆PAT2-agrC經(jīng)測(cè)序鑒定與GenBank上金葡菌N315株的agrC核苷酸序列一致性為98.0％，氨基酸序列一致性為98.5％。SDS-PAGE結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET28a(+)-agrC在大腸桿菌中成功表達(dá)，磁珠分選系統(tǒng)有效純化了目的蛋白。 2、采用親和篩選法，以

9、agrC為靶分子，經(jīng)過(guò)4輪篩選，從噬菌體12肽庫(kù)中獲得了可與agrC特異結(jié)合的噬菌體克隆。 3、從上述獲得的噬菌體克隆中隨機(jī)挑取60個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增和純化，發(fā)現(xiàn)22個(gè)克隆與agrC結(jié)合力顯著強(qiáng)于對(duì)照組。提示它們與agrC結(jié)合可能是特異的。 4、將這些陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA序列分析及氨基酸序列推導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)不同的DNA序列，其中3個(gè)有共同的核心序列，這些克隆的核心序列為(XX)L(X)Q(XX)L(XX)L(X)。

10、 5、人工合成agrC結(jié)合多肽N1、N2、N4及無(wú)關(guān)多肽NO，觀察到N1在細(xì)菌生物膜的粘附、聚集期對(duì)金葡菌N315及ATCC25923生物膜形成能力有明顯抑制效應(yīng)；N1多肽還能影響生物膜相關(guān)粘附聚集因子atlE和ica轉(zhuǎn)錄水平及其蛋白表達(dá)，同時(shí)N1可以減少N315菌株TSST-1毒素的分泌。而N0、N2、N4對(duì)生物膜形成能力及其相關(guān)因子沒(méi)有明顯影響。經(jīng)ELISA檢測(cè)證實(shí)N1是與agrC結(jié)合力最高的特異性多肽，其氨基酸序列為CRLEQER

11、LSPLI。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)獲得了agrC蛋白的表達(dá)與純化。 2、從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選獲得了22個(gè)可與agrC特異結(jié)合的噬菌體克隆，經(jīng)。DNA序列分析及氨基酸序列推導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)不同的氨基酸序列，其中3個(gè)有共同的核心序列，這些克隆的核心序列為(XX)L(X)O(XX)L(XX)L(X)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)N1是與agrC結(jié)合力最高的多肽，其氨基酸序列為CRLEQERLSPLI。 3、人工合成N1多