folP1與folP2基因在磺胺甲惡唑-甲氧芐啶抗分枝桿菌中的作用機制研究.pdf

1、結核?。╰uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobactrium tuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染病。耐藥TB的出現使得TB成為嚴重的公共衛(wèi)生問題和社會問題，現有的抗TB藥物已經不能滿足需要，新藥的研發(fā)顯得更為迫切。然而新藥的研發(fā)又需要耗費大量的時間與金錢，如果能利用已經應用于臨床的藥物來治療TB，將使得TB藥物的研發(fā)更加快速、便宜。磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole，SMX)在體內和體外均具

2、有抗TB作用，是治療耐藥TB的候選藥物之一。在臨床上SMX與甲氧芐啶(trimethoprim，TMP)聯合用于治療細菌引起的呼吸道、泌尿道和胃腸道感染。研究發(fā)現SMX與TMP主要作用機制分別是靶向葉酸合成途徑中的二氫蝶酸合酶(dihydropteroic acid synthase，DHPS)和二氫葉酸還原酶(dihydrofolic acid，DHFR);但是SMX與TMP在分枝桿菌中的作用機制至今還未被闡明。
　　本研究旨在

3、探究分枝桿菌中folP1與folP2基因在TMP-SMX抗分枝桿菌中的作用，從而加速以TMP-SMX為基礎的抗TB新藥的研發(fā)。在分枝桿菌中，folP1基因編碼DHPS，而folP2基因編碼的蛋白與其具有同源性。本研究通過在恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，Msm）中分別過表達Mtb和Msm的folP1/2基因及敲除Msm folP2基因，得到重組菌株Msm∷p60fp1，Msm∷p60fp2，Msm∷p60M

4、sfp1，Msm∷p60Msfp2和Msm△folP2，再通過固體平板法檢測SMX和TMP對這些重組菌株的的最小抑制濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。結果發(fā)現在Msm中過表達MtbfolP1基因會使SMX和TMP的MIC都增加4倍;在Msm中過表達Msm folP1基因會使SMX和TMP的MIC都增加2倍。另外，敲除Msm的folP2基因后，SMX對其的MIC降低至野生型Msm的1/8，這

5、可能是由于folP2基因產物的存在減弱了SMX的抑菌效果，暗示了FolP2抑制劑與SMX聯用時可能會有較好的抗TB效果。
　　在本研究中我們也在嘗試改進分枝桿菌基因敲除技術。由于Mtb生長緩慢，需要在P3實驗室操作等原因，許多已存在的高效率的基因敲除技術都不能應用于Mtb。在過去20年，雖然出現了大量的分枝桿菌基因敲除技術，但這些技術，要么需要通過電轉化將DNA轉入分枝桿菌體內，要么需要利用噬菌體作為載體將同源的DNA遞送到Mtb

6、菌內，然后通過同源重組達到基因敲除的目的。分枝桿菌電轉化效率低，再加上同源重組的低效率極大地限制了相關技術在分枝桿菌中的應用，尤其是慢速分枝桿菌。即便是最近引入了重組工程的方法來增強重組效率，利用電轉化獲得基因敲除株的效率仍然很低;然而構建噬菌體的方法，需要體外包裝的步驟，不僅制備昂貴而且受到DNA包裝大小的更嚴格的限制。本研究通過改進的方法將等位交換底物（allelic exchange substrates，AESs）插入分枝桿菌p