分枝桿菌wecA基因的功能研究.pdf

1、結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的最嚴(yán)重的疾病之一,自20世紀(jì)80年代起,已經(jīng)受到控制的結(jié)核病疫情再次抬頭。結(jié)核病的致病菌是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Tb),該細(xì)菌具有特殊細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),對其生存和繁殖極為重要。其核心結(jié)構(gòu)由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸組成。其中聚阿拉伯半乳糖與肽聚糖之間靠L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子連接。銜接雙糖是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁極其重要的結(jié)構(gòu),破壞這一結(jié)構(gòu),細(xì)胞壁的完

2、整性將遭到破壞從而結(jié)核分枝桿菌不能生存。
　　 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子的合成第一步驟是在一個N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,將G1cNAc-1-P(N-乙酰葡糖胺-1-磷酸)基團(tuán)轉(zhuǎn)移到C50-P(Decaprenyl phosphate)上形成C50-P-P-GlcNAc。顯而易見,在以上的酶促反應(yīng)中,這個N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶起到了非常關(guān)鍵的銜接作用,如果該酶被破壞掉,雙糖銜接分子將不能

3、合成。
　　 在大腸桿菌(E. coli)中,WecA酶的功能是作為N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶而參與脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的重要組成成分O-抗原多糖(O-antigenic polysaccharide,O-PS)的合成。BLAST分析表明,E. coli的WecA氨基酸序列與M.tuberculosis WecA氨基酸序列有27％的相似性,提示M.tuberculosis的WecA很可能也具

4、有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性,可以將GlcNAc-P基團(tuán)轉(zhuǎn)移到C50-P上,再接受鼠李糖基完成雙糖銜接分子的合成。
　　 本文實(shí)驗(yàn)的目的是:(1)通過在wecA基因缺陷菌株E.coil MV501導(dǎo)入結(jié)核分枝桿菌Rv1302以及恥垢分枝桿菌MSMEG_4947基因,驗(yàn)證兩個基因編碼酶的功能以及利用高效液相和質(zhì)譜進(jìn)行酶功能的鑒定。(2)確定wecA基因?yàn)榻Y(jié)核桿菌生長必需基因。用同源重組方法建立mc2155wecA基因敲除

5、菌株。通過測定wecA基因敲除菌株的生長曲線,研究wecA基因與分枝桿菌生長的關(guān)系。利用溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn),造成mc2155wecA基因敲除菌株缺乏WecA,通過比對掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)結(jié)果來研究WecA缺乏對該突變株細(xì)菌的形態(tài)學(xué)以及結(jié)構(gòu)的影響。在含有營救質(zhì)粒的mc2155 wecA基因敲除菌液中加入不同濃度的衣霉素,通過繪制細(xì)菌生長曲線來觀察衣霉素對WecA酶功能的抑制作用。(3)WecA酶在不同大腸桿菌宿主中的表達(dá)以及酶

6、活性檢測。利用表達(dá)載體。pET16b攜帶Tb wecA分別轉(zhuǎn)化到不同的大腸桿菌BL21(DE3),C41(DE3)以及ER2566中。表達(dá)WecA蛋白并提取上述各轉(zhuǎn)化菌的膜蛋白,進(jìn)行點(diǎn)雜交以及Western blot分析,并在適合條件下與底物一起進(jìn)行酶促反應(yīng),通過高效液相色譜來檢測底物UDP-G1cNAc濃度的變化,從而判斷WecA是否在不同大腸桿菌宿主中得到表達(dá)。
　　 本文獲得以下結(jié)果:
　　 1.對wecA基因缺陷

7、菌株E.coli MV501中LPS合成缺陷的補(bǔ)償以及WecA酶功能的鑒定
　　 將pMD18-Sm wecA質(zhì)粒(pYJ-1)和pMD18-Tb weeA質(zhì)粒(pYJ-2)電轉(zhuǎn)化到wecA基因缺陷菌株E.coli MV501中,提取LPS并且進(jìn)行電泳。以未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的MV501以及轉(zhuǎn)化了pUC18質(zhì)粒的MV501作為陰性對照。根據(jù)電泳結(jié)果,可以看到在轉(zhuǎn)化了pYJ-1和pYJ-2的MV501中出現(xiàn)了清晰的LPS條帶,而陰性對照

8、細(xì)菌中提取的LPS則沒有相應(yīng)的條帶。
　　 提取上述三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli MV501細(xì)菌的膜蛋白。將膜蛋白與底物C50-P以及UDP-GleNAc一起進(jìn)行孵育,反應(yīng)上清中UDP-GlcNAc含量的變化通過高效液相以及高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀來檢測。檢測的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化了pYJ-1質(zhì)粒和pYJ-2質(zhì)粒的細(xì)胞膜蛋白反應(yīng)體系中,底物UDP-GlcNAc的含量與陰性對照相比有所減少。
　　 2.wecA基因是結(jié)核桿菌生長必需基

9、因以及衣霉素對WecA蛋白的抑制作用
　　 (1)wecA基因缺陷菌株mc2155 YJ-2的構(gòu)建
　　 酶切pUC4K質(zhì)粒獲得Kan抗性基因(KanR)并克隆到pYJ-1質(zhì)粒中,產(chǎn)生Sm wgcA::KanR突變基因。再將突變基因克隆到pPR27-xv1E質(zhì)粒,構(gòu)建出條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xy1E-Sm wecA::KanR(pYJ-4)。
　　 酶切質(zhì)粒pY1-2,獲得Tb wceA基因,克隆到pET23

10、b-Phsp60質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建出pET23b-Phsp60-Tb weeA(pYJ-5)質(zhì)粒。酶切pYJ-5,將酶切后的片斷Phsp60-Tb wecA克隆到pCG76質(zhì)粒,構(gòu)建出pCG76-Tb weeA營救質(zhì)粒(pYJ-6)。
　　 將pYJ-4電轉(zhuǎn)化到mc2155感受態(tài)細(xì)菌中,42℃條件下SmwecA::KanR與mc2155基因組中的Sm wecA發(fā)生同源重組。Southern雜交分析顯示發(fā)生第一次同源重組的mc2

11、155 YJ-1突變菌株有兩種同源重組方式,＃2,7,8菌株以第一種方式發(fā)生同源重組,＃3,4,13,16菌株以第二種方式發(fā)生同源重組。
　　 將pYJ-6營救質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到mc2155 YJ-1感受態(tài)細(xì)菌中,用含10%蔗糖的選擇性LB瓊脂培養(yǎng)基,這種選擇壓力下,mc2155 YJ-1基因組中的San wecA::KanR與Sm wecA發(fā)生第二次同源重組。用Southern印跡方法篩選出mc2155 YJ-2突變菌株,即Sm w

12、ecA基因敲除菌株。
　　 (2)mc2155 YJ-2生長曲線的測定
　　 測定mc2155 YJ-2突變菌株在30℃和42℃的生長曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變菌株在30℃可以生長,但在42℃不生長,說明wecA基因是分枝桿菌生長必需基因。
　　 在隨后的溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中,讓mc2155 YJ-2突變菌株在營救質(zhì)?？梢詮?fù)制、表達(dá)的30℃生長20小時,使之表達(dá)一定量Tb WecA蛋白后,提高溫度至42℃,使pYJ-6不能復(fù)

13、制,影響Tb WecA蛋白的表達(dá)。在Tb WecA逐漸缺乏的情況下,測定mc2155 YJ-2突變菌株的生長曲線。結(jié)果顯示mc2155 YJ-2突變菌株可以在42℃繼續(xù)增殖1-2天,第三天以后細(xì)菌的生長受到抑制,菌量開始減少,這進(jìn)一步說明wecA基因是分枝桿菌生長必需基因。
　　 (3)WecA缺乏對突變菌株mc2155 YJ-2細(xì)菌形態(tài)的影響
　　 在溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中,取mc2155 YJ-2突變菌株細(xì)菌用掃描電鏡觀察其

14、細(xì)菌形態(tài)。結(jié)果顯示在30℃條件下,該mc2155 YJ-2突變菌株均呈短棒狀、輪廓飽滿、表面光滑的形態(tài)。與野生型對照無明顯差異。但在42℃條件下,營救質(zhì)粒Tb wecA表達(dá)受影響致使WecA蛋白缺乏時,一些細(xì)菌表面出現(xiàn)明顯易見的皺褶、凹陷,細(xì)菌之間有相互粘連以及融合,許多細(xì)菌的一端開始出現(xiàn)腫脹。生長144小時的細(xì)菌輪廓極不規(guī)則,細(xì)菌腫脹更加厲害,很多細(xì)菌表面有大量破損。
　　 透射電鏡結(jié)果顯示,30℃培養(yǎng)生長72小時以及144小

15、時的細(xì)菌結(jié)構(gòu)正常,可見完整的細(xì)胞外膜,細(xì)菌形狀規(guī)則。在42℃培養(yǎng)72小時后,細(xì)胞外膜出現(xiàn)皺褶,細(xì)胞膜有脫落。在42℃培養(yǎng)144小時后,細(xì)菌形狀明顯不規(guī)則,有脹大的頭部和細(xì)長的尾部出現(xiàn),細(xì)菌內(nèi)部溶解并有大量空泡,部分細(xì)菌中部出現(xiàn)橫隔。
　　 掃描電鏡以及透射電鏡結(jié)果說明WecA蛋白質(zhì)的缺乏影響細(xì)胞壁的合成,使細(xì)菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。
　　 (4)衣霉素對Tb WecA酶功能的抑制
　　 含有營救質(zhì)

16、粒的mc2155 YJ-2基因敲除菌株在30℃進(jìn)行培養(yǎng)24小時,在菌液中加入不同濃度的衣霉素繼續(xù)培養(yǎng),每隔24小時進(jìn)行一次菌液吸光度的測定,培養(yǎng)120小時之后繪制細(xì)菌生長曲線,根據(jù)細(xì)菌生長情況判斷衣霉素對WecA蛋白功能的影響。生長曲線表明加入衣霉素的細(xì)菌生長受到一定程度的抑制,其抑制程度與衣霉素的濃度呈正相關(guān)。
　　 3.Tb WecA酶在不同宿主大腸桿菌中的表達(dá)以及酶活性測定
　　 將Tb wecA基因與pET16b

17、載體相連后,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同的大腸桿菌宿主BL21(DE3),C41(DE3)以及ER2566菌株中,提取膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE以及Western blot檢測,未見到有明顯雜交條帶出現(xiàn),但是點(diǎn)雜交結(jié)果顯示為陽性。將上述所有膜蛋白與底物C50-P以及UDP-GlcNAc一起進(jìn)行孵育,上清中UDP-GlcNAc的含量通過高效液相色譜來檢測。檢測結(jié)果表明,反應(yīng)體系中的底物UDP-G1cNAc與對照相比都有不同程度的減少。
　　 結(jié)

18、論:
　　 1.在E.coli wecA基因缺陷菌株MV501中導(dǎo)入攜帶Sm wecA和TbwecA的質(zhì)粒,質(zhì)粒可以表達(dá)并補(bǔ)償E.coli MV501 WecA蛋白缺陷,補(bǔ)償性合成LPS。初步判斷在分枝桿菌中WecA具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶功能。
　　 2.運(yùn)用HPLC方法以及LC/MS/MS方法分別檢測了在E.coli wecA基因缺陷菌株MV501中表達(dá)的Sm WecA和Tb WecA酶活性,并對其酶促反應(yīng)

19、條件進(jìn)行了優(yōu)化。證明了Sm wecA和Tb wecA基因編碼的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶功能。
　　 3.以恥垢分枝桿菌mc2155菌株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?構(gòu)建了mc2155 wecA敲除突變菌株mc2155 YJ-2。通過研究mc2155 YJ-2在30℃和42℃生長情況,確定Tb wecA基因?yàn)榉种U菌生長必需基因。
　　 4.通過對mc2155 YJ-2在溫度轉(zhuǎn)換(從30℃到42℃)實(shí)驗(yàn)中生長的研究,進(jìn)

20、一步證實(shí)了wecA基因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌生長必需基因。
　　 5.通過掃描電鏡和透射電鏡觀察了mc2155 YJ-2在溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化,證明了WecA缺乏會引起一系列細(xì)菌形態(tài)變化及結(jié)構(gòu)的改變,最終可能引起細(xì)菌死亡。
　　 6.在mc2155 YJ-2細(xì)菌中分別加入不同濃度衣霉素進(jìn)行生長曲線的測定,結(jié)果表明衣霉素抑制Tb WecA酶的活性,并且其作用具有濃度依賴性。
　　 7.本研究所獲得wecA基因

21、敲除菌株mc2155 YJ-2可作為篩選WecA抑制劑的細(xì)菌模型來篩選先導(dǎo)化合物,以便發(fā)現(xiàn)特異性高且對人體無毒副作用的抗結(jié)核新藥。
　　 8.初步嘗試在不同大腸桿菌中表達(dá)膜蛋白WecA,并運(yùn)用點(diǎn)雜交方法加以印證。通過HPLC檢測酶促反應(yīng)中底物的減少,再次印證Tb WecA具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶功能。
　　 本研究結(jié)果確定了Tb wecA作為結(jié)核桿菌生長必需基因決定著細(xì)菌的存亡,并驗(yàn)證了Tb WecA的酶功能,

22、分別用不同方法證實(shí)了WecA是N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶,參與細(xì)胞壁重要結(jié)構(gòu)雙糖銜接分子的合成,其酶活性可以被衣霉素所抑制。
　　 未來研究方向:
　　 1.選擇合適的載體以及表達(dá)菌株,優(yōu)化WecA的表達(dá)條件,實(shí)現(xiàn)膜蛋白WecA的高表達(dá)以及純化。
　　 2.在底物存在條件下體外模擬WecA酶促反應(yīng)過程,用放射自顯影或者TLC方法進(jìn)一步確定WecA酶活性。
　　 3.研究wecA基因敲除菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)

23、。從在42℃生長的wecA基因敲除細(xì)菌中提取胞漿蛋白進(jìn)行雙向電泳,重復(fù)和優(yōu)化雙向電泳條件,并根據(jù)雙向電泳結(jié)果,對感興趣的蛋白質(zhì)差異點(diǎn)用胰蛋白酶進(jìn)行酶解,然后用質(zhì)譜方法獲得肽質(zhì)譜并與數(shù)據(jù)庫比對,以發(fā)現(xiàn)更多的靶點(diǎn)。然后進(jìn)一步采用分子生物學(xué)的方法,克隆這些差異蛋白的基因,鑒定其功能,以期發(fā)現(xiàn)wecA基因與其它基因之間是否存在相互調(diào)控相互影響的關(guān)系。
　　 4.分別提取30℃和42℃生長的wecA基因敲除細(xì)菌的細(xì)胞壁,用HPLC分析兩者