Ipr1基因在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染中的作用與機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題從C57BL/6J小鼠的胸腺組織通過RT-PCR法獲得Iprl(intracellular pathogen resistance 1，細(xì)胞內(nèi)病原體抗性基因1)基因全長編碼序列，克隆入真核表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平鑒定了Iprl基因的表達(dá)，并確定了Iprl基因表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)定位。觀察了Iprl基因的表達(dá)對巨噬細(xì)胞生長狀態(tài)的影響及巨噬細(xì)胞體外抗分枝桿菌H37Ra感染活性的影響。運(yùn)用

2、基因芯片技術(shù)檢測Iprl基因的表達(dá)與巨噬細(xì)胞抗Mtb感染的免疫應(yīng)答機(jī)制中的相關(guān)因素之間相互關(guān)系，初步探討了Iprl基因在巨噬細(xì)胞抗Mtb感染中的作用機(jī)制。 第一部分 Iprl基因的獲取及原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá) 目的：獲取Iprl基因全長編碼序列，構(gòu)建Iprl基因原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，制備抗Iprl多克隆抗體。 方法：從C57BL/6J小鼠胸腺組織提取總RNA，以RT-PCR法調(diào)取Iprl

3、基因編碼序列，上下游引入BamHⅠ、PstⅠ酶切位點(diǎn)，克隆至pMD19-T simple載體中獲得重組質(zhì)粒pMD19-T simple-Iprl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選的陽性克隆作PCR及酶切鑒定后測序分析。其中的突變堿基經(jīng)點(diǎn)突變修復(fù)，測序正確后獲得含正確Iprl序列的重組質(zhì)粒﹡pMD19-T simple-Iprl。將Iprl基因亞克隆于原核表達(dá)載體pQE30，獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-Iprl；以重組質(zhì)粒﹡pMD19-T s

4、imple-Iprl為模板，PCR法擴(kuò)增Iprl基因，上下游分別引入Kpn I、BamH I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建另一原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Iprl。將pQE30-Iprl轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株SG13009、M15；pET32a(+)-Iprl轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21、BL21(pLyS)，IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：從C57BL/6J小鼠胸腺組織內(nèi)擴(kuò)增出大小為1338bp片段。陽性克隆測序鑒

5、定發(fā)現(xiàn)一個點(diǎn)突變，經(jīng)點(diǎn)突變修復(fù)后與GenBank報道的Iprl基因序列一致。亞克隆獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-Iprl經(jīng)酶切鑒定正確，構(gòu)建的另一原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Iprl經(jīng)測序鑒定正確。pQE30-Iprl、pET32a(+)-Iprl分別在其相應(yīng)表達(dá)菌株IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，均未成功表達(dá)出Iprl重組蛋白。 結(jié)論：成功獲取小鼠Iprl基因全長編碼序列并成功構(gòu)建含Iprl基因的兩種原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-Iprl、

6、pET32a(+)-Iprl，但I(xiàn)prl基因原核表達(dá)獲取重組蛋白未獲成功，提示Iprl基因原核表達(dá)可能有一定難度。 第二部分 目的：構(gòu)建小鼠Iprl基因與EGFP基因融合表達(dá)載體，鑒定Iprl基因在小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。 方法：限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BαmHⅠ雙酶切重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Iprl及真核表達(dá)載體pEGFP-C1，獲得的Iprl基因片段與pEGFP-C1載體

7、大片段連接后獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Iprl，經(jīng)PCR、酶切鑒定正確后，脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-Iprl至小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，以空質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組作為對照。采用RT-PCR法、Western blotting法分別在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平檢測Iprl基因的表達(dá)及用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。 結(jié)果：成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Iprl，瞬時轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW

8、264.7，經(jīng)RT-PCR、Western-blotting鑒定Iprl基因在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平獲得表達(dá)，Iprl基因編碼產(chǎn)物分子量大約50kD左右，熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡觀察Iprl融合綠色熒光蛋白表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了Iprl基因與EGFP基因融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Iprl，成功轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平檢測到Iprl基因表達(dá)，Iprl基因表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)。 第

9、三部分 Iprl基因表達(dá)對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7生長的影響及殺傷分枝桿菌作用的研究 目的：觀察Iprl基因表達(dá)對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的生長狀態(tài)的影響，以及Iprl基因的表達(dá)對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞體外殺傷結(jié)核分枝桿菌H37Ra作用的影響。 方法：1.采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法將Iprl基因真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Iprl轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C1作為

10、對照組，應(yīng)用MTT法檢測Iprl基因的表達(dá)對巨噬細(xì)胞的生長是否有抑制作用；應(yīng)用TUNEL原位凋亡檢測Iprl基因表達(dá)對巨噬細(xì)胞是否有致凋亡作用。2.應(yīng)用G418壓力篩選穩(wěn)定表達(dá)Iprl基因的小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞，獲得高表達(dá)Iprl基因的巨噬細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞)，同時篩選空質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞(對照組細(xì)胞)。3.體外感染分枝桿菌H37Ra，感染后24h及96h細(xì)胞裂解物細(xì)菌培養(yǎng)菌落計數(shù)(CFU)的方法觀

11、察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(Iprl+)、對照組細(xì)胞(Iprl-)抗結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染活性。 結(jié)果：1.MTT法檢測未發(fā)現(xiàn)Iprl基因的表達(dá)對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7有抑制生長的作用；TUNEL原位凋亡檢測結(jié)果末發(fā)現(xiàn)Iprl基因的表達(dá)對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7有促凋亡的作用。2.經(jīng)G418壓力篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)Iprl基因的RAW264.細(xì)胞及空GFP表達(dá)的RAW264.細(xì)胞。3.細(xì)胞水平抗分枝桿菌H37Ra實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ip

12、rl基因的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞裂解物細(xì)菌培養(yǎng)菌落計數(shù)(CFU)低于對照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。 結(jié)論：Iprl基因的表達(dá)產(chǎn)物對巨噬細(xì)胞的增殖無抑制作用，也不引起巨噬細(xì)胞凋亡。G418壓力篩選出高表達(dá)Iprl基因的細(xì)胞。體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明Iprl基因的表達(dá)增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞殺傷胞內(nèi)吞噬的結(jié)核分枝桿菌H37Ra的能力。 第四部分基因芯片初步探討Iprl基因的表達(dá)對巨噬細(xì)胞結(jié)核抗分枝桿菌感染免疫應(yīng)答的影響

13、 目的：應(yīng)用小鼠固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答功能分類cDNA芯片檢測Iprl基因在巨噬細(xì)胞的表達(dá)對感染結(jié)核分枝桿菌H37Ra的巨噬細(xì)胞抗感染免疫應(yīng)答相關(guān)機(jī)制的影響及相互關(guān)系。 方法：實(shí)驗(yàn)組(Iprl+)巨噬細(xì)胞RAW264.7與對照組(Iprl-)巨噬細(xì)胞RAW264.7分別感染結(jié)核分枝桿菌H37Ra，于感染96h后分別提取兩組的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及線性生物素標(biāo)記的cRNA，純化cRNA后與小鼠固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答功能

14、分類基因芯片(113個基因位點(diǎn))雜交，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測基因芯片雜交結(jié)果，采集圖像經(jīng)軟件分析得到基因表達(dá)差異的結(jié)果。應(yīng)用實(shí)時定量PCR法對芯片結(jié)果中上調(diào)的3個基因檢測以驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。 結(jié)果：基因芯片結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Iprl基因的表達(dá)上調(diào)了11個巨噬細(xì)胞抗Mtb固有免疫機(jī)制中的有關(guān)分子的基因轉(zhuǎn)錄，其中與巨噬細(xì)胞抗Mbt感染關(guān)系密切的基因有：參與TLRs信號通路的分子：TLR2、TLR4、Irak1、Traf6，以及干擾素相

15、關(guān)基因：Ifngr1(IFN-γR1)和腫瘤壞死因子相關(guān)基因：Tnfrsfla(TNFR1)。而巨噬細(xì)胞參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)的分子的基因表達(dá)如：IL-1、TNF-α、IL-12等表達(dá)無明顯差異。對于3個表達(dá)下調(diào)的基因Clecsf12、Illrap、Ltf由于其標(biāo)準(zhǔn)值較低(＜0.05)，其準(zhǔn)確度較低，可能意義不大。經(jīng)定量PCR反應(yīng)對TLR2、TLR4及Ifngr1的檢測結(jié)果與芯片結(jié)果分析表明定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果趨勢一致。