水稻細(xì)菌性條斑病菌HrpX調(diào)控元受HrpD6調(diào)控的機(jī)理研究.pdf

1、水稻細(xì)菌性條斑病菌（簡稱水稻條斑病菌）（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）是稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)種下的致病變種之一，從水稻的氣孔和傷口侵入，產(chǎn)生水稻細(xì)菌性條斑病(Bacterial Leaf Streak，BLS)，是水稻上重要的細(xì)菌病害。同其他的革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌一樣，水稻條斑病菌也含有保守的hrp(hypersensitive response and pathogen

2、icity)基因簇，決定其在非寄主植物上的過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)和在感病寄主上的致病性(pathogenicity)。細(xì)菌與水稻互作時(shí)，通過由hrp基因簇編碼組裝形成Ⅲ型泌出系統(tǒng)(TypeⅢ Secretion System，T3SS)，將各類效應(yīng)蛋白注入植物細(xì)胞中從而導(dǎo)致植物產(chǎn)生抗（感）病性。
　　 水稻條斑病菌的hrp基因簇包含27個(gè)基因，除由調(diào)節(jié)因子HrpG和HrpX進(jìn)行調(diào)控外，新

3、發(fā)現(xiàn)的HrpD6蛋白也參與調(diào)控過程，它對hpa2、hpal、hrcC、hrcT和hpaB具有調(diào)控作用。有關(guān)HrpD6如何與HrpX協(xié)同性或獨(dú)立性地調(diào)控上述基因，機(jī)理尚不清楚。
　　 上述五個(gè)基因中，hpaB基因所在的hrpD操縱單元除hpaB外，其他基因均不受HrpD6調(diào)控，推測hpaB還存在另外的啟動子。為了明確hpaB基因的啟動子，本研究以水稻條斑病菌野生型菌株RS105為出發(fā)菌株，通過功能互補(bǔ)hpaB基因突變菌株R△hpa

4、B，發(fā)現(xiàn)hpaB基因除了其所在的hrpD操縱單元的啟動子(DoB)，毗鄰hpaB基因上游的一段區(qū)域(upB)也具有啟動子活性，參與hpaB基因毒性功能的發(fā)揮，暗示可能upB啟動子可能參與HrpD6對hpaB的調(diào)控。
　　 為了研究HrpD6對上述基因的調(diào)控是否通過直接的蛋白與DNA結(jié)合的方式實(shí)驗(yàn)，我們用酵母單雜交進(jìn)行初篩，結(jié)果顯示HrpD6對hpal和hpa2基因的啟動子具有結(jié)合活性，但不能結(jié)合hpaB基因的啟動子，進(jìn)一步的凝膠

5、滯阻實(shí)驗(yàn)證實(shí)HrpD6能結(jié)合hpal和hpa2基因的啟動子中的PIP-box序列。這說明HrpD6對hpal和hpa2的調(diào)控是一種直接的作用，而對hpaB則是一種間接的調(diào)控。
　　 既然HrpD6與HrpX存在相似的調(diào)控特征，為了查明兩者的關(guān)系，進(jìn)行了酵母雙雜交，結(jié)果表明HrpD6與HrpX并不存在互作關(guān)系，隨后的EMSA揭示二者存在競爭關(guān)系。為了檢測HrpD6與HrpX對基因的調(diào)控過程是否完全相同，選擇hpal基因的PIP-b

6、ox，截短后進(jìn)行EMSA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HrpD6可結(jié)合PIP-box兩側(cè)TTCGC基序及其Nx序列，而HrpX不能結(jié)合Nx;分析Nx序列發(fā)現(xiàn)受HrpD6調(diào)控的基因中多存在類似TTCGC或其互補(bǔ)序列AAGCG，據(jù)此規(guī)律我們對已報(bào)道的受HrpX調(diào)節(jié)的基因的Nx進(jìn)行分析，然后通過RT-PCR檢測，最終獲得兩個(gè)Nx中含有類似TTCGC(AAGCG)的基因受HrpD6調(diào)控。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示稻黃單胞菌致病機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，及進(jìn)一步發(fā)掘HrpD6調(diào)

7、控因子提供線索。
　　 水稻條斑病菌的HrpX能夠調(diào)節(jié)hrp基因的表達(dá)，而在被調(diào)節(jié)的因子啟動子區(qū)域一般含有PIP-box。因此PIP-box可以作為一個(gè)有效的篩選標(biāo)記從大量的基因組數(shù)據(jù)中獲得HrpX調(diào)節(jié)子。基因組信息提示，水稻條斑病菌的很多基因在啟動子區(qū)域都含有完整或不完整的PIP-box。因此為了從水稻條斑病菌中獲得更多受HrpX調(diào)節(jié)的基因，本研究選取5個(gè)候選因子(hrpB1、avrBs2、ecpA、kgtP和Z1234)借助