水稻細菌性條斑病菌Tn5突變體的表型篩選與突變位點定位.pdf

1、水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pathovar oryzicola，Xoc）引起的水稻細條病對廣西部分地區(qū)水稻產(chǎn)量造成影響。隨著水稻與Xoc菲律賓代表菌株BLS256相繼測序成功，Xoc—水稻的互作已成為研究病原菌—植物互作的模式之一。廣西菌株GX01的測序也基本完成，如此豐富的靜態(tài)堿基序列信息正等待著我們從中挖掘動態(tài)的病原菌生物學(xué)功能。突變體庫是功能基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)座子可移動及可體外驅(qū)動轉(zhuǎn)座的特點被廣

2、泛應(yīng)用于介導(dǎo)插入突變體庫的構(gòu)建，逐漸成為一個研究黃單胞菌的強大工具。
　　 本研究以廣西菌株Xoc GX01作為建庫出發(fā)菌株，利用EZ-Tn5TM轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的方法構(gòu)建了Tn5插入突變體庫。第一次電轉(zhuǎn)化共保存2965個單克隆的轉(zhuǎn)化子，并對這一批轉(zhuǎn)化子的胞外多糖、胞外蛋白酶、游動性、生物膜等表型進行檢測。目前已完成的2200個突變體表型篩選中，我們篩選到胞外多糖分泌能力增強的突變體26個，胞外多糖分泌能

3、力減弱的突變體31個，胞外蛋白酶活性增強的突變體77個，胞外蛋白酶活性減弱的突變體16個，游動性增強的突變體61個，游動性減弱的突變體507個，并發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)生物膜現(xiàn)象的突變體67個。
　　 為了驗證確實有轉(zhuǎn)座子的插入，我們從突變體庫中隨機選取了17個突變體，提取它們的總DNA，用鑒定引物PCR驗證，均能擴增出568 bp的目的產(chǎn)物，證明這些轉(zhuǎn)化子均有Tn5插入，假陽性率低。并利用質(zhì)粒拯救的方法進一步獲取其轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，與Xoc

4、GX01全基因組進行本地序列比對(BLAST)，相似性百分比在97％以上，側(cè)翼序列的真實性比較高，是一種相對高效的定位方法。
　　 同時，我們從篩庫過程中選取表型變化相對明顯的突變體BH90和BA87進行致病力檢測，它們的致病力均有不同程度的下降，其定位信息分別為XOC2200和XOC2216。為進一步研究這兩個基因的功能，同時構(gòu)建了XOC2200和XOC2216的缺失突變體及其互補菌株。XOC2200的編碼產(chǎn)物為Transcr

5、iptional regulator，flagellar regulatoryprotein A; XOC2216的編碼產(chǎn)物為flagellar biosynthesis hook protein。其中Tn5插入突變體BH90及XOC2200的缺失突變體胞外多糖及游動性顯著提高，互補菌株表型基本能夠恢復(fù)到野生型狀態(tài)，推測XOC2200可能反向調(diào)控胞外多糖的合成及Xoc的游動性。Tn5插入突變體BA87及XOC2216的缺失突變體胞外蛋白