水稻細菌性條斑病菌突變體庫的構(gòu)建與致病相關(guān)基因的篩選.pdf

1、水稻細菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepathovaroryzicola，簡稱Xoc)是水稻的主要病原菌之一，其引發(fā)的水稻細菌性條斑病可造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)。但目前還沒有有效的方法控制該病的發(fā)生，國內(nèi)外對Xoc的分子致病機理的研究還處于初步階段，因此系統(tǒng)地研究該菌致病相關(guān)基因的功能是非常有必要的。本研究從廣西分離株LT4分離到具有利福平抗性的野生型菌株XocGX01作為建庫出發(fā)菌株。首先對其進行了分子鑒定，致病力檢測和表型分

2、析，證明其確實為水稻細條病菌。采用EZ:TN轉(zhuǎn)座子簽法構(gòu)建了XocGX01菌株的Tn5隨機插入突變體庫，共獲得52，392個突變體，轉(zhuǎn)化效率較高。利用改良后的針刺接種法在水稻日本晴品種上進行致病性試驗，從572個Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體中篩選到致病性明顯下降或完全喪失的突變體48株，并對它們進行致病力評價分析，發(fā)現(xiàn)它們的致病力的降低程度不同，其中下降大于70％的有7株。為了了解這48個致病力下降突變體其表型的變化，對它們進行了表型分析。結(jié)

3、果顯示，其中大部分致病缺陷的突變體其表型都有不同的變化。利用TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)的方法分離出突變體基因組中的Tn5轉(zhuǎn)座子側(cè)翼片段，經(jīng)測序分析和序列比對，將這48個突變體的Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點進行了定位，定位到39個基因。結(jié)果表明，這些突變體的表型和致病力與定位出來的基因的功能對應(yīng)程度較高。這48個突變體涉及到39個不同的基因，包括：已知的致病相關(guān)基因，分別是與分泌系統(tǒng)、胞外多糖

4、和脂多糖合成有關(guān)的基因；一部分與細菌基礎(chǔ)代謝、基因調(diào)節(jié)相關(guān)的基因；6個編碼產(chǎn)物都注釋為假設(shè)蛋白的基因，未見與致病性相關(guān)的報道，可能參與DNA甲基化、RNA結(jié)構(gòu)形成以及其它未知生物學(xué)功能。為了確定這6個基因是致病相關(guān)基因從而證明該突變體庫的正確性，對其中一個基因的突變體進行功能互補，結(jié)果表明其互補菌株的表型及致病力都能恢復(fù)到野生型的水平，說明該突變體是正確可信的。進而說明采用EZ:TN轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法構(gòu)建的Tn5突變體庫作為篩選以及研究致病相