模擬微重力效應對海藻酸鈉三維培養(yǎng)心肌細胞的影響.pdf

1、微重力可致航天員在太空飛行過程中生理機能發(fā)生改變。這些變化主要包括心血管系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的病理性改變,其中心血管系統(tǒng)病理性改變是造成空間飛行過程中航天員不能順利完成空間作業(yè),甚至猝死的主要原因。因此,探討微重力對心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響及其相關(guān)機制,可為進一步建立基于生物醫(yī)學基礎(chǔ)的有效防護措施提供理論基礎(chǔ),對于保證航天員在太空飛行時的健康和有效工作具有重要意義。
　　由于在空間進行微重力實驗耗資大,機會有限,因此地面

2、模擬微重力效應是目前空間生物學與航天醫(yī)學研究的主要研究方式。為了克服模擬微重力效應研究中細胞二維培養(yǎng)的不足,本研究構(gòu)建了一種新型的海藻酸鈉微囊體,使細胞在該載體內(nèi)呈三維生長,以保證盡可能實現(xiàn)在體細胞的特征。為了選擇力學性能穩(wěn)定,可以對抗回轉(zhuǎn)過程產(chǎn)生的剪切力作用的載體材料,本實驗首先利用流變儀檢測了不同組成成分的海藻酸鈉微囊體力學性能,結(jié)果顯示1:30:0.05海藻酸鈉/膠原/殼聚糖為最佳組成。掃描電鏡顯示微囊體為內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu),有利于細胞

3、培養(yǎng)。其次,細胞增殖實驗表明心肌細胞在該微囊體內(nèi)的穩(wěn)定增殖,原代心肌細胞在微囊體內(nèi)可形成類心肌組織,并維持長期搏動。因此,海藻酸鈉/膠原/殼聚糖微囊體包覆心肌細胞可用于后續(xù)微重力效應的相關(guān)研究。
　　為了進一步研究海藻酸鈉微囊體用于模擬微重力效應研究的可靠性,本研究利用回轉(zhuǎn)儀以轉(zhuǎn)數(shù)15rpm回轉(zhuǎn)培養(yǎng)24hr,比較海藻酸鈉微囊體和cytodex微球為載體的心肌細胞微絲結(jié)構(gòu)改變,發(fā)現(xiàn)兩者微絲結(jié)構(gòu)變化相似,此外不同表型的乳腺癌細胞在海藻

4、酸鈉微囊體中回轉(zhuǎn)培養(yǎng)48hr后,乳腺癌細胞的生物學特性發(fā)生改變,表明海藻酸鈉微囊體用于模擬微重力效應研究的可行性。
　　在構(gòu)建以海藻酸鈉微囊體為載體的細胞三維培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上,本文利用免疫熒光染色、MTT和流式細胞儀等方法研究了模擬微重力效應對心肌細胞結(jié)構(gòu)、增殖和凋亡的影響,結(jié)果表明模擬微重力效應24hr導致三維培養(yǎng)的心肌細胞偽足消失,增殖能力降低,36hr出現(xiàn)早期凋亡,并在回轉(zhuǎn)培養(yǎng)72hr時出現(xiàn)DNA損傷。
　　為了深入研究

5、模擬微重力效應對三維培養(yǎng)的心肌細胞功能的影響及其相應機制,本研究還分析了心肌細胞搏動頻率的變化,通過顯微鏡觀察海藻酸鈉微囊體內(nèi)心肌細胞的搏動頻率,發(fā)現(xiàn)模擬微重力效應24hr可致原代心肌細胞收縮頻率改變,表明模擬微重力效應改變?nèi)S培養(yǎng)的心肌細胞的搏動功能。同時利用實時定量PCR和Western-blot分析了模擬微重力效應與介導興奮-收縮耦聯(lián)的縫隙連接蛋白Connexin43以及影響心肌功能的離子通道蛋白(鈉離子通道蛋白、L-鈣離子通道蛋

6、白、鈉鉀泵、鈉氫交換體)表達變化的關(guān)系,研究結(jié)果提示模擬微重力效應對編碼鈉通道的基因SCN5a表達未造成明顯影響,而其余通道蛋白均有不同程度的表達變化(Connexin43表達呈一過性改變,可產(chǎn)生適應性恢復;L-鈣通道蛋白表達增高;鈉鉀泵和鈉氫交換體表達降低),說明模擬微重力效應改變了動作電位產(chǎn)生的分子基礎(chǔ),從而導致心肌搏動功能改變。此外,尾懸吊大鼠實驗也表明模擬微重力效應改變了心肌離子通道蛋白表達,其中Connexin43和鈉氫交換體

7、改變與體外培養(yǎng)的心肌細胞改變一致,而L-鈣通道蛋白和鈉鉀泵表達與體實驗相反,以上研究結(jié)果提示神經(jīng)體液調(diào)控參與了模擬微重力效應下心肌組織離子通道蛋白的表達。
　　在以上研究的基礎(chǔ)上,為了深入分析模擬微重力效應下線粒體氧化應激響應的協(xié)同變化,利用線粒體特異探針熒光染色、活性氧探針DCFH-DA、Rh123染色以及抗氧化酶活性檢測試劑盒研究了心肌細胞氧化應激的發(fā)生及相關(guān)機制,結(jié)果表明模擬微重力效應24hr心肌線粒體分布發(fā)生改變,48hr

8、細胞活性氧顯著增加,線粒體膜電位改變,導致心肌處于氧化應激狀態(tài)。同時心肌細胞抗氧化物酶活性增強、熱休克蛋白和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB高表達?？寡趸颯OD活性分析表明回轉(zhuǎn)培養(yǎng)的氧化應激機制可能以超氧化物為主。此外,線粒體的氧化應激研究結(jié)果也提示氧化應激參與了心肌細胞模擬微重力效應的響應機制,而且與心肌細胞搏動變化及部分離子通道的變化具有一致性。
　　綜上,本研究通過構(gòu)造新型海藻酸鈉微囊體,建立了適用于模擬微重力效應研究的細胞三維培養(yǎng)體系