大葉鉤藤藥學(xué)及藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 大葉鉤藤 Uncaria macrophylla Wall.屬于茜草科 Rubiaceae鉤藤屬Uncaria植物,《中華人民共和國藥典》2010年版收載,作為中藥正品鉤藤來源的一個(gè)種。大葉鉤藤主要分布于廣東、廣西、云南等省,具有清熱平肝、息風(fēng)定驚之功效,是中醫(yī)臨床治療肝風(fēng)內(nèi)動(dòng),驚癇抽搐的常用中藥。
　　 作為中藥鉤藤,傳統(tǒng)的藥用部位是帶鉤莖枝,但最近的研究發(fā)現(xiàn)鉤藤葉這一部位的化學(xué)成分與帶鉤莖枝相似,并

2、且鉤藤葉遠(yuǎn)比鉤藤帶鉤莖枝的產(chǎn)量高,可見鉤藤葉作為一種藥用資源,來源豐富,藥用價(jià)值及綜合利用潛力都很大。目前由于缺乏對(duì)鉤藤葉進(jìn)行系統(tǒng)的藥學(xué)和藥理毒理學(xué)研究,使其一直沒有被開發(fā)利用,大量的鉤藤葉資源一直處于廢棄狀態(tài)。而在鉤藤屬藥用植物及近緣種中,大葉鉤藤葉的重量和產(chǎn)量最大。目前有關(guān)大葉鉤藤葉的藥理作用尚未見報(bào)道。
　　 研究目的：
　　 對(duì)大葉鉤藤進(jìn)行資源調(diào)查,進(jìn)行大葉鉤藤葉生藥學(xué)研究和主要化學(xué)成分測(cè)定,并在此基礎(chǔ)上,對(duì)大葉

3、鉤藤藥理作用進(jìn)行初步研究,主要觀察其對(duì)中樞神經(jīng)的影響和抗藥物依賴的作用,為該藥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.大葉鉤藤主要分布于華南及西南地區(qū)。應(yīng)用植物分類學(xué)與植物地理學(xué)方法,就近選點(diǎn),在粵西地區(qū)進(jìn)行大葉鉤藤資源豐度,利用狀況及生態(tài)環(huán)境等方面的調(diào)查,并采集制作臘葉標(biāo)本。
　　 2.生藥學(xué)鑒定方法:采集大葉鉤藤藥材標(biāo)本,對(duì)鉤藤葉進(jìn)行性狀鑒別,顯微鑒別采用石蠟切片法觀察葉片主脈及葉肉組織結(jié)

4、構(gòu)、采用水合氯醛透化法觀察葉片粉末特征、采用表面撕片法觀察葉面氣孔及表皮細(xì)胞形態(tài),理化鑒別采用生物堿沉淀反應(yīng)及硅膠薄層層析色譜法對(duì)大葉鉤藤中生物堿進(jìn)行比較。
　　 3.主要化學(xué)成分測(cè)定:采用HPLC法測(cè)定大葉鉤藤不同部位有效成分鉤藤堿、異鉤藤堿含量,色譜柱為Hypersil ODS C18柱(4.6m×200mm,5um)；甲醇-水(含0.5％三乙胺,冰乙酸調(diào)PH6.334)=63:37為流動(dòng)相,流速0.8ml·min-1,進(jìn)樣

5、量為5.0μl,檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm,柱溫為室溫。
　　 4、大葉鉤藤對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響
　　 4.1小鼠自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)昆明種小鼠60只,雌雄各半,禁食12h,飲水不限。將小鼠隨機(jī)分為6組,即空白對(duì)照組(等容量生理鹽水組),陽性藥組(地西泮1mg/kg),鉤組(即大葉鉤藤帶鉤莖枝,下同)組(20g/kg)和大葉鉤藤葉低(5g/kg)、中(10g/kg)、高(20g/kg)三劑量組,每組10只動(dòng)物。將各組小鼠放入YLS-I

6、A多功能小動(dòng)物自主活動(dòng)記錄儀中,適應(yīng)5min后,測(cè)定小鼠給藥前的自主活動(dòng)次數(shù),記錄時(shí)間為5min。記錄時(shí)室內(nèi)保持安靜。然后按劑量給各組小鼠灌胃給藥。分別于給藥后30min、60min、120min各測(cè)定1次自發(fā)活動(dòng)數(shù),記錄5min內(nèi)各組小鼠的活動(dòng)數(shù)。
　　 4.2戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量誘導(dǎo)小鼠入睡試驗(yàn)取昆明種小鼠55只,雌雄大致各半。將小鼠隨機(jī)分為5組,即空白對(duì)照組(等容量生理鹽水組),陽性藥組(地西泮1mg/kg),鉤組(即大

7、葉鉤藤帶鉤莖枝,下同)組(20 g/kg)和大葉鉤藤葉低(5g/kg)、高(20g/kg)劑量組,每組11只動(dòng)物。按各組劑量給小鼠ig給藥,藥后60min后給每只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg,以小鼠翻正反射消失1min以上為入睡標(biāo)準(zhǔn),記錄1.5min內(nèi)各組小鼠的入睡個(gè)數(shù)。
　　 4.3戊巴比妥鈉閾劑量誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間試驗(yàn)取昆明種小鼠40只,雌雄各半,分組同上,每組8只動(dòng)物。按各組劑量給小鼠ig給藥,藥后60min后給每只

8、小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/g,然后記錄各組小鼠的睡眠時(shí)間(以給藥后小鼠翻正反射消失為入睡時(shí)間,翻正反射消失至恢復(fù)為睡眠時(shí)間)。
　　 4.4硫酸士的寧致小鼠驚厥試驗(yàn):取昆明種小鼠75只,雌雄大致各半,分組同上,每組15只動(dòng)物。按各組劑量給小鼠ig給藥,給藥后60min,腹腔注射硫酸士的寧(2mg/kg),記錄注射士的寧后2h內(nèi)驚厥小鼠數(shù)和死亡小鼠數(shù),驚厥反應(yīng)以小鼠出現(xiàn)四肢陣攣或強(qiáng)直性驚厥為指標(biāo)。
　　 5.大葉鉤藤

9、對(duì)小鼠苯丙胺依賴位置偏愛效應(yīng)(CPP)及腦內(nèi)單胺遞質(zhì)的影響
　　 取經(jīng)過自然位置偏愛測(cè)定合格的SPF級(jí)昆明小鼠,按隨機(jī)分組原則分為①空白對(duì)照組,②苯丙胺模型組,③模型組+大葉鉤藤帶鉤莖枝組(20mg/kg),④模型組+大葉鉤藤葉高劑量組(20mg/kg),⑤模型組+大葉鉤藤葉低劑量組(5mg/kg),⑥大葉鉤藤純鉤組(20mg/kg),每組10只,雌雄各半。②～⑤組偶數(shù)天上午(8:00)腹腔注射(ip)苯丙胺(2 mg·kg-1

10、),奇數(shù)天上午(8:00)腹腔注射(ip)等體積生理鹽水,⑥組按相應(yīng)劑量灌胃(ig)給予大葉鉤藤鉤提取物；③～⑤組于每日下午20:00(即給苯丙胺后12 h),分別按相應(yīng)劑量灌胃(ig)給予大葉鉤藤提取物；①組以同體積生理鹽水替代苯丙胺給藥,其它處理同②組。整個(gè)過程共持續(xù)8d,實(shí)驗(yàn)期間小鼠飲水進(jìn)食自由。實(shí)驗(yàn)時(shí)將位置偏愛箱中間的隔板放下,d1上午注射生理鹽水、苯丙胺及灌胃給予鉤藤堿后立即將小鼠置于白箱,d2上午注射及灌胃給予生理鹽水后立即

11、將小鼠置于黑箱,放置時(shí)間均為45min。以后的6 d均按上述方法操作,共8 d。在d9上午8:00(即最后一次給予苯丙胺24 h后)進(jìn)行位置偏愛檢測(cè),通過動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)記錄并分析小鼠15 min內(nèi)在白箱中停留的時(shí)間。完成CPP測(cè)定后,立即將各組小鼠麻醉后快速斷頭處死,迅速剝?nèi)∪X,置液氮中冷凍1分鐘后,放于-80℃保存待測(cè)。測(cè)試時(shí)取小鼠大腦部分,稱重,勻漿,經(jīng)離心等處理后制成樣品溶液,用熒光分光光度法測(cè)定樣品中NE、DA、5-HT的

12、含量。
　　 6.統(tǒng)計(jì)方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 x±s表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量方差分析,單因素方差分析,先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊則應(yīng)用Anova法進(jìn)行檢驗(yàn),用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較；如方差不齊,則應(yīng)用近似方差分析的welch法進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)用Dunnett's T3法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料采用 x2檢驗(yàn)。p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)大葉

13、鉤藤進(jìn)行資源調(diào)查發(fā)現(xiàn),廣東羅定西部蘊(yùn)藏豐富的大葉鉤藤資源,當(dāng)?shù)責(zé)o污染性工業(yè),生態(tài)環(huán)境優(yōu)良,植被保存比較完好,且有深厚的民間用藥文化背景,應(yīng)積極保護(hù)資源并進(jìn)一步合理開發(fā)利用。對(duì)大葉鉤藤葉進(jìn)行生藥學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),大葉鉤藤葉葉片較大,含眾多單細(xì)胞非腺毛,柵欄組織細(xì)胞2—3列,葉片薄璧細(xì)胞含草酸鈣簇晶,平軸式氣孔,薄層層析顯示與鉤藤對(duì)照藥材至少有2種相同的生物堿成分。
　　 2、大葉鉤藤生物堿含量的HPLC結(jié)果表明,鉤藤堿和異鉤藤堿在0

14、.02μg～5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r鉤藤堿=0.9999,r異鉤藤堿=1.0000,平均回收率分別為98.52％和99.12％,RSD鉤藤堿=2.045％,RSD異鉤藤堿=2.171％。鉤藤堿含量大葉鉤藤葉為0.016％,大葉鉤藤帶鉤莖枝為0.015％,異鉤藤堿含量大葉鉤藤葉為0.006％,大葉鉤藤帶鉤莖枝為0.004％。3藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響
　　 3.1藥物對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響處理組之間采用重復(fù)測(cè)量方差分析,重復(fù)因素

15、四個(gè)水平數(shù)據(jù)不滿足球?qū)ΨQ假設(shè)(P=0.009),取 Greenhouse—Gelsser校正結(jié)果。處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.187,P=0.003),四個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.010,P<0.001),時(shí)間因素和組別之間不存在交互效應(yīng)(F=1.605,P=0.091)。在每一時(shí)間點(diǎn)上不同處理組間的差異采用 One—Way ANOVA,給藥前與藥后30min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)方差齊(P=0.238,0.215),六個(gè)處理組之

16、間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F藥前=2.209,P藥前=0.067；F藥后30min=0.987,P藥后30min=0.434)；藥后60min方差齊(P=0.102),六個(gè)處理組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.346,P=0.009),空白組均高于其余五組(P=0.009,0.001,0.001,0.002,0.008),其余五組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)；藥后120min方差齊(P=0.199),六個(gè)處理組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

17、(F120min=3.538,P120min=0.008),空白組均高于帶鉤莖枝組、陽性藥組、葉低劑量組、葉高劑量組(P<0.001,P=0.004,0.017,0.005)。每一組在不同時(shí)間點(diǎn)上活動(dòng)次數(shù)的差異用重復(fù)測(cè)量方差分析,空白組在各時(shí)間點(diǎn)上數(shù)據(jù)不滿足球?qū)ΨQ假設(shè)(P=0.022),取Greenhouse—Geisser校正結(jié)果,四個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.010,P=0.018)；至藥后60分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;

18、陽性藥組數(shù)據(jù)滿足球?qū)ΨQ假設(shè)(P=0.077),四個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.261,P<0.001);至藥后60分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。帶鉤莖枝組、葉低劑量組、葉中劑量組、葉高劑量組數(shù)據(jù)均滿足球?qū)ΨQ假設(shè)(P=0.179,0.865,0.085,0.294),四個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.901,P<0.001；F=17.515,P<0.001;F=21.998,P<0.001；F=14.332,P<0.001),

19、均至藥后30分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？偟膩碚f,小鼠的活動(dòng)次數(shù)在給藥前后不同時(shí)間之間有差異,六組均在給藥前達(dá)到最大值,除空白組外其余五組給藥后活動(dòng)次數(shù)隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),至120min達(dá)到最小值。帶鉤莖枝組以及葉各劑量組于30分鐘即與給藥前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,陽性藥組至藥后60分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,大葉鉤藤組起效時(shí)間較快。
　　 3.2戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量誘導(dǎo)小鼠入睡實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組在腹腔注射閾下睡眠劑量的戊巴比妥鈉(3

20、0mg/kg)后,翻正反射消失小鼠為0只,陽性藥組有6只小鼠入睡,鉤組有7只小鼠入睡,葉低劑量組有5只小鼠入睡,高劑量組有4只小鼠入睡。由于有50％格子理論頻數(shù)小于5,取 Fisher確切概率法結(jié)果,P=0.015,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可認(rèn)為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.3戊巴比妥鈉閾劑量誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)各組小數(shù)睡眠時(shí)間數(shù)據(jù)經(jīng)One—Way ANOVA分析表明組間有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.676,P=0.00

21、1),需進(jìn)一步兩兩比較(采用 LSD法)。空白對(duì)照組與鉤藤葉低劑量組、帶鉤莖枝組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.959,P=0.274),與陽性藥組、葉高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004,P=0.001)。結(jié)果表明,葉高劑量組可使戊巴比妥鈉閾劑量所致小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng),且與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.569)
　　 3.4藥物對(duì)硫酸士的寧致小鼠驚厥作用的影響給小鼠腹腔注射士的寧(2mg/g)后,小鼠在5min內(nèi)出

22、現(xiàn)強(qiáng)直性驚厥和死亡。各組小鼠存活個(gè)數(shù)經(jīng) X2檢驗(yàn),50％格子數(shù)小于5,取Fisher確切概率法結(jié)果,P=0.133,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可認(rèn)為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的小鼠驚厥個(gè)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組小鼠驚厥時(shí)間經(jīng)One—Way ANOVA分析,levene檢驗(yàn)方差不齊,用近似 F檢驗(yàn) Welch法,P=0.003,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,經(jīng)兩兩比較,陽性藥組與空白對(duì)照組、帶鉤莖枝組、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余四組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,葉低劑

23、量組與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.142),但與其余3組比較亦差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,尚不能認(rèn)為它們之間藥效相似。
　　 4.藥物對(duì)小鼠苯丙胺依賴位置偏愛效應(yīng)(CPP)的影響給藥前各組數(shù)據(jù)方差不齊(P=0.022),取 Welch結(jié)果 P=0.309,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻讓?duì)照組小鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時(shí)間無明顯變化(P=0.162)。與給藥前比較,模型組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P=0.002)。表明模型

24、組小鼠對(duì)白箱產(chǎn)生CPP,小鼠苯丙胺CPP模型建立成功。與給藥前比較,低劑量組、高劑量組、帶鉤莖枝組、純鉤組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P=0.001)；而鉤藤堿低劑量組及高劑量組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時(shí)間與之比較無明顯差異。帶鉤莖枝組、低劑量組帶鉤莖枝組、純鉤組給藥后在白箱中的停留時(shí)間與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,P=0.006,P<

25、0.001)。用 One-Way ANOVA對(duì)各組單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析,各組 NE、DA、5-HT數(shù)據(jù)方差齊(P=0.738,P=0.120,P=0.072)、各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,P<0.001,P=0.033)。用LSD進(jìn)行多重比較,與空白對(duì)照組比較,模型組 NE、DA含量均升高(P<0.001),5-HT含量降低(P=0.033)；模型+鉤組NE含量升高(P=0.044)。純鉤組、模型+鉤組、模型

26、+高、低劑量組NE含量低于模型組(P<0.001)；純鉤組、模型+鉤組、模型+高、低劑量組DA含量低于模型組(P=0.002、P<0.001、P=0.001、P<0.001)；純鉤組、模型+鉤組5-HT含量高于模型組(P=0.002、P=0.01)；模型+高劑量組、模型+低劑量組的5-HT含量與模型組比較有升高趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.169,P=0.069)。
　　 結(jié)論：
　　 1、大葉鉤藤資源豐富,大葉鉤藤

27、葉的性狀鑒別和顯微特征均具有形態(tài)學(xué)規(guī)律,可作為對(duì)其進(jìn)行生藥鑒定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。生物堿沉淀反應(yīng)和薄層層析色譜分析結(jié)果表明,大葉鉤藤葉與鉤藤對(duì)照藥材在生物堿方面至少有兩種相同的成分。
　　 2.大葉鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿含量較高,本HPLC法準(zhǔn)確,操作簡(jiǎn)便、快速,重復(fù)性較好,精密度較高,可用于對(duì)鉤藤屬植物的總生物堿以及有效成分鉤藤堿、異鉤藤堿含量的測(cè)定。
　　 3、大葉鉤藤醇提物能夠顯著降低小鼠的自主活動(dòng),增加翻正反射消失的小鼠

28、數(shù),延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間。但不能減少硫酸士的寧引起的驚厥小鼠的死亡數(shù)以及硫酸士的寧致小鼠驚厥的潛伏時(shí)間。
　　 4.苯丙胺能使受試動(dòng)物產(chǎn)生明顯的位置偏愛效應(yīng),小鼠于伴藥箱中停留時(shí)間延長(zhǎng)。大葉鉤藤可以縮短成癮小鼠在伴藥箱中的停留時(shí)間,抑制苯丙胺小鼠依賴狀態(tài)下的CPP效應(yīng),使之與正常小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而正常小鼠給予大葉鉤藤并不會(huì)產(chǎn)生CPP,說明其本身并無成癮性。遞質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示,模型組小鼠大腦區(qū)DA、NE、5-HT含量均有異于空