sST2對重癥急性胰腺炎大鼠心肌損傷的影響及機制研究.pdf

1、背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由于在胰腺內(nèi)胰酶被激活后，胰酶造成自身胰腺組織消化、損傷性疾病，依據(jù)臨床嚴重程度又可將急性胰腺炎分為輕型急性胰腺炎、中重度急性胰腺炎以及重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。SAP占急性胰腺炎的比例大約是15％～20％，屬于臨床常見的急性重癥腹部疾病。SAP起病急、病情進展快，發(fā)病兇險，且伴有復(fù)雜的并發(fā)癥，具有并發(fā)癥嚴重、病死率高，常

2、并發(fā)肺、心、肝、腎、腸道等重要胰外臟器損傷。急性胰腺炎并發(fā)心臟損害，尤其是重癥急性胰腺炎并發(fā)心臟損害，又被稱為“胰心綜合征”，是導(dǎo)致重癥急性胰腺炎難以治愈，死亡率升高的并發(fā)癥之一。所表現(xiàn)的心臟損害包括心律失常、心功能改變、心肌缺血、中毒性心肌炎、心包炎、心包積液、休克、心力衰竭等癥狀，嚴重者可導(dǎo)致急性心肌梗死，甚至心臟驟停，因此重癥急性胰腺炎并發(fā)心臟損害備受關(guān)注，成為近年來的研究熱點。
　　人基質(zhì)裂解素2(human strome

3、lysin-2，ST2)屬于IL-1受體(interleukin-1receptor，IL-1R)超家族成員之一，ST2存在于多種組織細胞中，主要表達在心肌細胞上?？扇苄匀嘶|(zhì)裂解素2（soluble human stromelysin-2，sST2）是其重要的亞型之一，表達非常局限，在皮膚、視網(wǎng)膜、乳房和成骨組織中誘導(dǎo)性表達，也可從靜息纖維母細胞的激活誘導(dǎo)產(chǎn)生，和跨膜型ST2亞型的區(qū)別是沒有跨膜序列，也沒有胞內(nèi)受體結(jié)構(gòu)域，可被分泌到細

4、胞外。ST2是一種新發(fā)現(xiàn)的和多種心臟損傷相關(guān)的診斷標志物?？稍谘逯斜粰z測到，在血管動脈粥樣硬化斑塊中，也可檢測到sST2。sST2作為重要的靶點，對解釋心血管疾病的發(fā)生機制，以及診斷和預(yù)測心血管疾病預(yù)后具有重要作用，通過干預(yù)其信號傳導(dǎo)途徑，有希望對心血管疾病治療提供新的靶點。
　　然而近期一些研究已經(jīng)表明，sST2Fc融合蛋白的重組可以減弱肝缺血/再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并且抑制內(nèi)毒素休克模型中炎癥因子的產(chǎn)生，這進一步證實了sST

5、2具有抗炎作用。最近，還有研究表明sST2在急性胰腺炎病程早期表達增高，而在ST2缺陷小鼠中會發(fā)展為重癥胰腺炎。這些結(jié)果提示sST2可能參與了重癥急性胰腺炎的炎癥風暴過程，可能對重癥急性胰腺炎誘發(fā)的多器官功能障礙具有保護作用。
　　本課題主要是探討sST2在重癥急性胰腺炎并發(fā)心臟損傷中的表達情況，以及ST2在重癥急性胰腺炎并發(fā)心臟損傷發(fā)病過程中的作用，并探討其可能的相關(guān)機制和作用機理，為臨床上sST2作為重癥急性胰腺炎并發(fā)心臟損傷

6、的新型分子靶標，以及為重癥急性胰腺炎并發(fā)心臟損傷提供進一步的實驗基礎(chǔ)。
　　第一部分:sST2對重癥急性胰腺炎大鼠心肌細胞損傷的影響
　　目的:觀察sST2對SAP大鼠心肌細胞損傷的影響。
　　方法:進行SAP大鼠模型的制備，麻醉大鼠后，應(yīng)用1.5％去氧膽酸鈉溶液經(jīng)十二指腸乳頭逆行注射入膽胰管，構(gòu)建大鼠SAP模型，同時構(gòu)建腺病毒表達sST2載體。將大鼠分為對照組(Sham)，重癥急性胰腺炎組(SAP)，以及在SAP基礎(chǔ)

7、上轉(zhuǎn)入空載腺病毒組(SAP+Ad-GFP)，和在SAP基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入腺病毒表達sST2載體組(SAP+Ad-sST2)。分別用碘-淀粉比色法檢測血清淀粉酶水平，進行各組大鼠血氣分析，超聲心動圖分析各組心臟功能，HE染色評估心臟組織學病理改變，檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)濃度，心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、乳酸脫氫酶(LDH)改變，分析Na+-K+-ATPase活性，ELISA法檢測各組大鼠血清中細胞因子和sST2以及IL-33的表達;用T

8、UNEL法檢測心肌細胞凋亡情況，Western blot檢測心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白家族Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達情況;分別檢測各組大鼠心肌組織中血清髓過氧化物酶(MPO)、血清丙二醛(MDA)、心肌超氧化物歧化酶(SOD)的改變情況。
　　結(jié)果:與對照組(Sham)相比較，SAP組血清淀粉酶水平明顯增高(p＜0.01)，PaCO2顯著增高(p＜0.01)，PaO2顯著降低(p＜0.01)。而

9、在給予腺病毒過表達sST2干預(yù)的組中，血清淀粉酶水平明顯下降(p＜0.01);PaCO2顯著降低(p＜0.01)，PaO2顯著增高(p＜0.01)。與對照組相比，SAP大鼠中可見到左室室壁運動減弱，左心射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)的顯著降低(p＜0.01)，心肌病理切片出現(xiàn)大量心肌纖維異常，心肌細胞凋亡，大量炎性細胞浸潤。而在利用腺病毒給予過表達sST2后，LVEF和LVFS可顯著增加(p＜0.01)，心肌重構(gòu)得以顯

10、著改善。與對照組(Sham)相比較，SAP組大鼠血中CK-MB，cTnT和LDH水平明顯增加(p＜0.01)，Na+-K+-ATPase活性明顯降低(p＜0.05或p＜0.01)，而在給予腺病毒過表達sST2的干預(yù)組中，可以完全逆轉(zhuǎn)這些酶類的增加，促進Na+-K+-ATPase活性增加。SAP大鼠模型組心肌組織中有大量TUNEL陽性細胞，大量細胞被染成棕褐色，凋亡蛋白Bcl-2表達減少(p＜0.01)，凋亡蛋白Bax表達增加(p＜0.0

11、1)，cleaved-caspase3表達增加(p＜0.05)。而給予Ad-sST2注射，給予腺病毒過表達sST2干預(yù)后，可顯著降低TUNEL陽性細胞數(shù)量(p＜0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加(p＜0.01)，凋亡蛋白Bax表達減少(p＜0.01)，cleaved-caspase3表達減少(p＜0.01)。與對照組相比，SAP組大鼠血清中TNF-α，IL-1β，和IL-6表達顯著增加(p＜0.01)。與SAP組比較，給予Ad-s

12、ST2注射，可顯著改善致炎因子的表達，TNF-α，IL-1β，和IL-6表達急劇減少(p＜0.01)。與對照組相比，SAP組心肌組織中MDA，MPO水平明顯增加(p＜0.01)，SOD活性降低(p＜0.01)，而給予Ad-sST2注射后，可MDA，MPO產(chǎn)生減少(p＜0.01)，SOD活性增加(p＜0.05)。與對照組相比，SAP組大鼠血清中sST2和IL-33表達均顯著降低(p＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義。而給予Ad-sST2注射，給

13、予腺病毒過表達sST2干預(yù)后，與SAP組比較，sST2和IL-33表達增加(p＜0.05)。
　　結(jié)論:應(yīng)用1.5％去氧膽酸鈉制備了重癥急性胰腺炎大鼠模型且伴隨明顯的心肌損傷。利用腺病毒過表達sST2，可以降低SAP大鼠血清淀粉酶的水平，減少炎性因子的分泌，增加sST2和IL-33表達，改善心肌過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白和抗凋亡蛋白平衡，緩解SAP造成的心肌損傷等病理改變，抑制心肌細胞凋亡，進而改善心肌酶表達以及鈉鉀離子泵

14、活性，減輕心肌損傷，進而達到保護心臟功能，從而抑制SAP時多器官功能損害的進展。
　　第二部分:sST2對LPS引起心肌細胞損傷的影響和機制研究
　　目的:明確sST2治療心肌損傷的作用以及相關(guān)的機制。
　　方法:通過體外培養(yǎng)心肌細胞系H9C2細胞，并利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)構(gòu)建心肌細胞損傷模型，隨機將心肌細胞分為四組，空白對照組，LPS組，LPS+空載腺病毒組（即轉(zhuǎn)染載腺病毒后，加入

15、脂多糖作用），以及LPS+sST2過表達腺病毒組（轉(zhuǎn)染Ad-sST2基礎(chǔ)上，加入脂多糖作用于心肌細胞）。分別心肌細胞檢測Na+K++-ATPase活性改變，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6致炎因子以及IL-33和sST2在細胞上清水平的改變，流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡情況，Western blot法檢測心肌細胞中凋亡家族Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3以及ST2表達;并檢測心肌細胞上清液中CK-MB、

16、LDH活性和心肌細胞中MDA、MPO含量及SOD活性。
　　結(jié)果:通過流式細胞術(shù)對各組心肌細胞凋亡情況進行分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，LPS作用于心肌細胞后，引起大量心肌細胞凋亡;而轉(zhuǎn)染sST2過表達腺病毒后，可顯著降低心肌細胞凋亡數(shù)量(p＜0.01)。與對照組比較，LPS組中LPS作用于心肌細胞后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少(p＜0.01)，凋亡蛋白Bax表達增加(p＜0.05)，cleaved-caspase3表達增加(p＜0.

17、01)。與LPS組比較，轉(zhuǎn)染sST2過表達腺病毒后，可顯著減少凋亡蛋白Bax的表達及cleaved-caspase3的表達(p＜0.01)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(p＜0.01)。LPS組中心肌細胞ST2蛋白表達減少，而轉(zhuǎn)染sST2過表達腺病毒后ST2蛋白表達增加。與對照組比較，LPS組細胞上清中TNF-α，IL-1β，和IL-6水平顯著增加(p＜0.01)，IL-33和sST2水平降低(p＜0.01)，而心肌酶CK-MB和LDH

18、水平顯著增加(p＜0.01)，Na+-K+-ATPase活性明顯降低(p＜0.01);轉(zhuǎn)染sST2過表達腺病毒后細胞上清中TNF-α，IL-1β，和IL-6水平減少(p＜0.01)，IL-33和sST2水平增加(p＜0.05)，CK-MB和LDH減少(p＜0.01)，Na+-K+-ATPase活性增加(p＜0.01)。LPS組MDA和MPO水平明顯增加(p＜0.01)，而SOD活性明顯降低(p＜0.01);而給予Ad-sST2過表達后，

19、MDA和MPO水平明顯降低(p＜0.01)，而SOD活性明顯增加(p＜0.05)。
　　結(jié)論:sST2過表達于心肌細胞，可促進sST2蛋白表達，進而抑制膜受體的IL-33/ST2信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3的表達量，下調(diào)Bcl-2的表達量，從而調(diào)控凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡，調(diào)控脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，抑制多種炎性因子分泌，延遲心肌細胞凋亡，進而改善心肌酶表達，以及鈉鉀泵活性，緩解心肌損傷，進而達到