活化蛋白C對(duì)重癥急性胰腺炎療效及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過(guò)建立脂多糖(LPs)誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凋亡模型,觀察活化蛋白C(APC)的療效及機(jī)制.通過(guò)建立重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠模型,觀察APC治療SAP的療效,進(jìn)而了解蛋白C途徑主要成分表達(dá)水平和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路主要激酶的影響及后續(xù)炎癥介質(zhì)的變化.觀察SAP時(shí)肝臟的血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)以及APC的應(yīng)用對(duì)其的調(diào)節(jié)作用.最終,為今后該藥物的臨床應(yīng)用提供可能的理論依據(jù). 方法：

2、1.將培養(yǎng)成功的HUVECs通過(guò)LPS 1μg/ml誘導(dǎo)凋亡模型,并給予APC(10ng/ml或50ng/ml)設(shè)立治療組及對(duì)照組.通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法觀察細(xì)胞凋亡及增殖變化.另外,同時(shí)測(cè)定相關(guān)凋亡基因的表達(dá). 2.SD大鼠隨機(jī)分為:對(duì)照組、SAP組、SAP+注射溶媒組、不同劑量APC治療組(10μg/kg,50μg/kg).于造模后16小時(shí)取材,觀察各組凝血指標(biāo)(PT、APTT、vWF、D二聚體)水平、胰腺損傷程度(組織

3、學(xué)改變、濕/干重系數(shù)、血清淀粉酶、TNF-α、IL-8、CRP水平)及動(dòng)物生存率等指標(biāo). 3.SD大鼠隨機(jī)分為: SAP組、不同劑量APC治療組(10μg/kg,50μg/kg)、對(duì)照組,于造模后16小時(shí)取材. ①測(cè)定胰腺組織基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9),血栓調(diào)節(jié)素(TM)和內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)tuRNA和蛋白表達(dá). ②基因芯片篩選胰腺組織MAPKs信號(hào)通路基因表達(dá),Real-time PCR和Wes

4、ternblot驗(yàn)證該通路中胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun N端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(sAPK)、p38MAPK mRNA和蛋白的變化.同時(shí)檢測(cè)胰腺組織TNF-α和IL-1β蛋白水平.③動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠局部肝血流量(BF)、血容量(BV)、平均通過(guò)時(shí)間(MTT)、毛細(xì)血管表面通透系數(shù)(PS)和肝動(dòng)脈指數(shù)(PAF),24小時(shí)處死動(dòng)物行肝臟和胰腺組織學(xué)觀察. 結(jié)果： 1.LPS組細(xì)胞可見明顯的凋亡現(xiàn)

5、象,而通過(guò)APC治療的細(xì)胞凋亡改變顯著減輕和細(xì)胞凋亡率下降,細(xì)胞存活率和PCNA表達(dá)率增高,尤其在50ng/ml時(shí),與LPS組細(xì)胞比較有顯著差異(P<0.05).同時(shí)APC可上調(diào) Bcl-2,降低P53、Bax、Caspase3的表達(dá),并在50ng/ml劑量時(shí)與LPS組比較有顯著差異(P<0.01). 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果: ①凝血指標(biāo)在不同劑量APC治療組與SAP,SAP+注射溶媒組比較差異均有顯著意義(P<0.01或0.

6、05),并部分指標(biāo)(PT和D二聚體)在不同劑量APC治療組間有量效關(guān)系(P<0.01).同時(shí)不同劑量APC治療組與SAP,SAP+注射溶媒組比較胰腺損傷嚴(yán)重度顯著減輕(P<0.05),平均生存時(shí)間延長(zhǎng) (P<0.01). ②胰腺組織:MMP-9表達(dá)在APC 50μg/kg治療組下調(diào),而EPCR和TM表達(dá)上調(diào)(P<0.01,vs SAP組),同時(shí) TM表達(dá)在不同劑量APC治療組間呈量效性(P<0.01). ③APC50μg

7、/kg治療組與SAP組比較,胰腺組織p38MAPK和JNK/SAPK表達(dá)和活性降低,ERK1/2則增高,TNF-α和IL-1β水平降低(P<0.01),并且p38MAPK、P-ERK1/2和TVNF-α蛋白水平呈現(xiàn)量效關(guān)系(P<0.01). ④SAP組:BF,BV降低,MTT延長(zhǎng),PS增加,PAF下降,以24小時(shí)為顯著.而不同劑量APC治療組與SAP組比較上述指標(biāo)呈相反.尤其APC50μg/kg治療組在16小時(shí),24小時(shí)上述指標(biāo)

8、差異均有顯著意義(vs SAP組,P<0.0l或0.05),24小時(shí)肝組織損傷分級(jí)及胰腺損傷評(píng)分明顯較SAP組降低(P<0.01),與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著意義(P>0.05). 結(jié)論 1.APC通過(guò)調(diào)控相關(guān)凋亡基因的表達(dá),拮抗LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡并促進(jìn)增殖,發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用. 2.APC在SAP病程中除抗凝血作用外,同時(shí)抑制炎癥介質(zhì)的釋放,從而以上述兩種途徑阻斷疾病的進(jìn)展.其作用機(jī)制可能如下: