Chondroitinase和Clenbuterol治療可促進(jìn)成年大鼠脊髓損傷后軸突再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù).pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后，其永久性的功能喪失是由于上行和下行的軸突被離斷而缺乏成功的再生所導(dǎo)致。軸突再生的失敗，目前基本上歸因于成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中抑制再生的環(huán)境因素，在一個(gè)損傷后的CNS中，軸突嘗試再生將面臨髓磷脂關(guān)聯(lián)的抑制因子，以及膠質(zhì)瘢痕所形成的物理屏障。在SCI中心，幾種髓磷脂關(guān)聯(lián)的軸突再生抑制因子，如髓磷脂-Nogo-A，髓磷脂關(guān)聯(lián)糖蛋白(MAG)，少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(O

2、Mgp)，以及膠質(zhì)瘢痕中的各種抑制性細(xì)胞外基質(zhì)分子，如硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPGs)，NG2，aggrecan及brecican等，已被證實(shí)在損傷的脊髓環(huán)境中，對(duì)于抑制軸突再生起到關(guān)鍵作用。在嚴(yán)重的SCI中，如脊髓完全性橫斷，脊膜破損，將導(dǎo)致顯著的纖維浸潤(rùn)，大量膠質(zhì)細(xì)胞混雜于侵入的結(jié)締組織中。由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的CSPGs是抑制性的細(xì)胞外基質(zhì)分子家族中的主要一種。在很多活體實(shí)驗(yàn)中，Chondroitinase(chABC)已被證

3、實(shí)能有效地將CSPGs從SCI處清除并創(chuàng)造一個(gè)有利于再生的環(huán)境。研究者們采用一些聯(lián)合治療措施包括將各種細(xì)胞性非細(xì)胞性移植物置于SCI點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合其他藥物治療以促進(jìn)軸突再生己取得了一定成效。例如，通過(guò)Schwann細(xì)胞架橋和嗅覺(jué)神經(jīng)包繞的膠質(zhì)移植物與chABC聯(lián)合治療，自體外周神經(jīng)移植架橋和經(jīng)chABC修飾后的基質(zhì)，以及在SCI點(diǎn)移植入成纖維細(xì)胞架橋(成纖維細(xì)胞經(jīng)基因修飾可分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子)等。 目前認(rèn)為，促進(jìn)SCI后軸突再生的比

4、較有前景的治療措施之一，是提高cAMP水平。cAMP發(fā)揮該效用的前提是需要激活轉(zhuǎn)譯因子磷酸性cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(pCREB)，激活的CREB能夠克服髓磷脂相關(guān)的軸突再生抑制因子從而促進(jìn)活體的脊髓軸突再生。β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑Clenbuterol，可提高神經(jīng)細(xì)胞中cAMP水平。改善脊髓挫傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。電泳遷移率定量分析顯示，Clenbuterol或高水平的cAMP可誘導(dǎo)CCAAT/增強(qiáng)子粘合蛋白δ(C/EBPδ)與pCR

5、EB的增加。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)噲D明確在長(zhǎng)期存活的SCI模型中，不應(yīng)用任何移植物進(jìn)行架橋的情況下，在SCI點(diǎn)使用chABC酶降解CSPGs合并Clenbuterol治療，能否促進(jìn)軸突再生并跨越SCI處膠質(zhì)瘢痕。 實(shí)驗(yàn)方法： 在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用兩種SCI模型。第一種采用特殊的保留硬脊膜的SCI模型，即使用特制的手術(shù)刀在硬脊膜內(nèi)完成大鼠的第7頸段脊髓單側(cè)半橫切，將硬脊膜的損傷控制在最小范圍以減小結(jié)締組織浸潤(rùn)、膠質(zhì)瘢

6、痕形成，用以觀察Clenbuterol能否提供一個(gè)有利于再生的局部環(huán)境以及促進(jìn)離斷的軸突再生并穿越SCI點(diǎn)。成年Wistar大鼠(n=10-12)接受硬脊膜內(nèi)的第7頸段脊髓(C7)單側(cè)半橫切顯微手術(shù)。Clenbuterol以9 mg/L的劑量加入飲用水中，而對(duì)照組未給予任何治療。采用Cylinder試驗(yàn)和患肢抓力試驗(yàn)觀察運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)狀況。對(duì)于逆行神經(jīng)示蹤，在行為學(xué)觀察期(6周)結(jié)束后，大鼠接受第二胸段脊髓處椎板切開(kāi)術(shù)，4％ Fluor

7、ogold微量注射進(jìn)入紅核脊髓束，一周后被處死。第二種模型中，各組Wistar大鼠(n=5-8)在第10胸段脊髓(T10)給予破壞脊膜的完全性橫切術(shù)，然后，在SCI處給予chABC和/或Clenbuterol(9mg/L，加入飲水中)，或者未給予任何治療。在SCI后，采用BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)12周評(píng)價(jià)其后肢運(yùn)動(dòng)功能。行為學(xué)觀察期結(jié)束后，在第13胸髓節(jié)段給予4％熒光金(Fluorogold，F(xiàn)G)用于逆行神經(jīng)示蹤。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

8、 在C7脊髓單側(cè)半橫切實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，從SCI后第3周開(kāi)始，Clenbuterol治療組顯著優(yōu)于對(duì)照組(最終患肢抓力：403.45±19.82g vs 335.13±13.48g，p<0.05)，在Cylinder試驗(yàn)中，雙側(cè)前肢共同使用觸壁的百分比，Clenbuterol組顯著高于對(duì)照組(43.39％±5.85％vs 19.42％4±6.61％，p<0.05)。Clenbuterol治療顯著地降低了SCI后繼發(fā)性組織損傷

9、，提高了pCREB陽(yáng)性細(xì)胞核在整個(gè)SCI點(diǎn)的表達(dá)水平。逆行神經(jīng)示蹤顯示，與對(duì)照組相比，Clenbuterol顯著地促進(jìn)了紅核脊髓束軸突的再生。 在T10脊髓完全性橫斷性損傷模型中，其結(jié)果表明，應(yīng)用chABC治療可減少膠原蛋白浸潤(rùn)，減少膠質(zhì)瘢痕的長(zhǎng)度，并可顯著降解CSPGs(p<0.05)。與未治療組對(duì)比，只有Clenbuterol+chABC組顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的運(yùn)動(dòng)功能改善，最終BBB評(píng)分為3.94。脊髓完全性橫斷性損傷后，病

10、理結(jié)果顯示，在SCI中心無(wú)任何正常的中樞神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)保留，我們采用抗體RT97作為軸突的標(biāo)記物，觀測(cè)在膠質(zhì)瘢痕中的再生軸突密度。在脊髓橫斷切片上，SCI中心及距中心頭側(cè)和尾側(cè)各500μm處，其軸突密度各組分別為：Clenbuterol+chABC組，5801.3±413.3/mm2，7178±494.4/mm2，和6496.2±205/mm2，顯著高于未治療組：4035.9±492.2/mm2，4416.6±605.8/mm2及4136

11、.3±532.1/mm2(p<0.05)。逆行神經(jīng)示蹤結(jié)果顯示，僅于Clenbuterol+chABC組動(dòng)物腦中檢測(cè)到FG標(biāo)記的陽(yáng)性神經(jīng)元。Clenbuterol治療在整個(gè)SCI處增加了pCREB陽(yáng)性細(xì)胞核的表達(dá)。完全性損傷后的脊髓瘢痕內(nèi)更加類似于外周神經(jīng)形態(tài)，再生的軸突由Schwann細(xì)胞形成髓鞘而不是由少突膠質(zhì)細(xì)胞形成。 結(jié)論： 1、在硬脊膜破損、結(jié)締組織浸潤(rùn)被降至最低程度的情況下，減少SCI后繼發(fā)性神經(jīng)組織缺失，激

12、活pCREB以克服阻礙軸突再生的抑制因子，從而促進(jìn)軸突再生，改善運(yùn)動(dòng)功能，是β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑Clenbuterol可能的作用機(jī)制之一。 2、Chondroitinase可降低脊髓完全性橫切后結(jié)締組織的浸潤(rùn)，縮小膠質(zhì)瘢痕，并有效地清除軸突再生的抑制因子CSPGs，為神經(jīng)功能恢復(fù)和軸突再生提供了有利的局部環(huán)境。 3、在不給予任何細(xì)胞性/非細(xì)胞性移植物的情況下，通過(guò)在SCI處酶降解CSPGs，結(jié)合Clenbuterol