調(diào)控mTOR信號(hào)通路和神經(jīng)活動(dòng)促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、作為全球青壯年人群重要的致殘?jiān)?，脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）一直以來(lái)都是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是亟待有效治療手段的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerves system,CNS）損傷性疾病之一。從脊髓損傷的病理機(jī)制來(lái)講，損傷造成的神經(jīng)傳導(dǎo)束斷裂-軸突（axon）斷裂，大腦與脊髓失去信息聯(lián)系無(wú)疑是導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙的主要原因之一。因此，如何促進(jìn)受損神經(jīng)纖維的軸突再生（axon reg

2、eneration），恢復(fù)腦-脊髓之間的信息聯(lián)系是治療脊髓損傷的重要突破口。
　　研究表明，軸突再生主要受到以下兩方面因素的影響：（1）損傷局部的抑制性微環(huán)境，如髓鞘相關(guān)抑制因子（Myelin-associated inhibitors, MAIs），硫酸軟骨素蛋白多糖（Chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs），膠質(zhì)瘢痕（glia scar）等。（2）減弱的成體神經(jīng)元內(nèi)在再生能力。通過(guò)調(diào)控外

3、源性抑制因素，比如敲除Nogo、促進(jìn)CSPGs的降解等方式，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷動(dòng)物的再生能力有所增加、軸突可塑性增強(qiáng)，部分研究甚至觀察到小鼠具有更好的行為學(xué)表現(xiàn)。但是，在這些針對(duì)局部抑制因素的調(diào)控措施中，很少觀察到長(zhǎng)距離（>1mm）的軸突再生。而且，調(diào)控外源性因素對(duì)控制隨意運(yùn)動(dòng)最重要的傳導(dǎo)束-皮質(zhì)脊髓束（corticospinal tract，CST）的再生影響有限。另外，增強(qiáng)的神經(jīng)可塑性和出芽再生也能夠在一定的康復(fù)訓(xùn)練策略中獲得。以上研究提

4、示，提高中樞神經(jīng)元的內(nèi)源性再生能力可能更為重要。
　　研究發(fā)現(xiàn)，敲除Pten（phosphatase and tensin homolog，磷酸酶及張力蛋白同源物）基因能夠提高神經(jīng)元的的內(nèi)源性軸突再生能力。Pten是一種腫瘤抑制基因，具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酶兩種活性，對(duì)PI3K/AKT/mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，mTOR）具有負(fù)調(diào)控作用。mTOR通路的激活幾乎都能夠改變目前所有已知的細(xì)胞代謝狀況，促進(jìn)生長(zhǎng)所必須的結(jié)構(gòu)單位和大分

5、子物質(zhì)的合成，在接受細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)刺激和調(diào)控細(xì)胞代謝狀態(tài)過(guò)程中起了核心控制作用。mTOR不僅可以被營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子或特定的細(xì)胞環(huán)境所激活，其活性也隨著CNS的發(fā)育（視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、皮質(zhì)神經(jīng)元）完成而下調(diào)。條件性敲除視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell,RGC）的Pten基因可以促進(jìn)鉗夾損傷的視神經(jīng)軸突出現(xiàn)明顯的再生反應(yīng)。激活的mTOR信號(hào)通路還有效的減少了由損傷引起的RGC細(xì)胞死亡。同樣，在脊髓損傷模型中也發(fā)現(xiàn)條件性敲

6、除皮質(zhì)神經(jīng)元的Pten基因能夠促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束（corticospinal tract,CST）的軸突再生，隨后，該方法被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室重復(fù)并且證實(shí)有效，成為調(diào)控再生內(nèi)源性因素的核心分子通路。
　　但是在以往這些針對(duì)PTEN和mTOR的再生研究中，學(xué)者們大多采用轉(zhuǎn)基因小鼠（將目的基因插入LoxP位點(diǎn)之間，以實(shí)現(xiàn)條件性敲除）作為研究對(duì)象；由于起始表達(dá)時(shí)間較慢，攜帶Cre同源重組酶的腺相關(guān)病毒（Adeno-associated vir

7、us,AAV）也需要在損傷之前數(shù)周（一般四周，甚至更長(zhǎng)時(shí)間）注射到感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)。RNA干擾（RNAi）作為有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的方式已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中。但是，在活體研究中，ShRNA和SiRNA都需要鉚定于相應(yīng)的病毒載體上。而目前感染非分裂細(xì)胞（皮質(zhì)神經(jīng)元）的慢病毒和腺相關(guān)病毒存在持續(xù)表達(dá)、基因組整合等不確定的風(fēng)險(xiǎn)，加之Pten持續(xù)敲除增加了發(fā)生腫瘤、癲癇等風(fēng)險(xiǎn)。這些問(wèn)題的存在限制了調(diào)控內(nèi)源性再生能力以促進(jìn)軸突再生、治

8、療脊髓損傷的臨床轉(zhuǎn)化可能。
　　基于HIV-1的Tat的蛋白降解肽-Degron是一種能夠有效、快速、可逆的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白降解，實(shí)現(xiàn)蛋白水平調(diào)節(jié)的干預(yù)方式。該肽段包含三個(gè)部分：Tat結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)穿膜；蛋白結(jié)合域，負(fù)責(zé)與目標(biāo)蛋白結(jié)合；降解誘導(dǎo)序列。研究顯示，利用該方法敲減（death associated protein kinase1,DAPK1）并誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。而且，最近一項(xiàng)利用該方法NA-1降解肽的研究（目標(biāo)蛋白為PS

9、D95，敲減后有神經(jīng)保護(hù)作用）在92例腦卒中患者中做了II期的臨床試驗(yàn)，初步證明本方法安全有效。因此，該方法有望成為調(diào)控體內(nèi)靶標(biāo)蛋白表達(dá)的重要備選方式，逐漸受到關(guān)注。本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性的針對(duì) PTEN的降解肽，并在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和脊髓損傷模型中驗(yàn)證了該Degron對(duì)軸突再生的促進(jìn)作用。最后我們將探討在敲除Pten激活mTOR信號(hào)通路的基礎(chǔ)上利用化學(xué)遺傳學(xué)方法提高神經(jīng)活動(dòng)對(duì)脊髓損傷小鼠軸突再生的促進(jìn)作用和功能恢復(fù)作用。
　

10、　主要方法：
　　1、利用自行設(shè)計(jì)的鉗夾鉗制備小鼠頸5（C5）脊髓鉗夾損傷模型；使用圓筒試驗(yàn)、水平樓梯、梳理測(cè)試、廂式食物抓取試驗(yàn)、BMS評(píng)分等方式評(píng)價(jià)C5脊髓鉗夾傷模型小鼠的行為學(xué)特點(diǎn)；利用免疫熒光法檢測(cè)脊髓損傷局部GFAP、CSPGs、Iba-1、MAG、Nogo-A等抑制性蛋白和膠質(zhì)激活情況；使用順行示蹤法評(píng)價(jià)控制隨意運(yùn)動(dòng)的皮質(zhì)脊髓束、紅核脊髓束在損傷后的情況；使用逆行示蹤法分析SCI后皮質(zhì)神經(jīng)元和紅核神經(jīng)元mTOR通路的活

11、性。
　　2、根據(jù)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)、合成針對(duì)PTEN蛋白的Degron；建立體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（DRG）并驗(yàn)證；使用WB檢測(cè)PTEN Degron對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元PTEN蛋白的敲減情況；使用免疫熒光檢測(cè)PTEN Degron對(duì)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)情況和mTOR通路的激活情況；制備人工CSPGs抑制性微環(huán)境，檢測(cè)PTEN Degron對(duì)DRG生長(zhǎng)的刺激作用。
　　3、利用皮質(zhì)局部注射和微量泵持續(xù)泵入兩種手段分別檢測(cè)PTEN

12、 Degron對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元mTOR通路的激活情況；免疫熒光法檢測(cè)PTEN Degron注射后對(duì)皮質(zhì)存在的可能炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)細(xì)胞刺激；使用兩種顏色示蹤劑，順行示蹤C(jī)ST以檢驗(yàn)PTEN Degron持續(xù)微量泵入對(duì)C5鉗夾傷小鼠的軸突再生促進(jìn)作用；檢測(cè)PTEN Degron對(duì)SCI小鼠行為學(xué)的影響。
　　4、利用化學(xué)遺傳法DREADDs（特異性藥物激活的特異性受體）和轉(zhuǎn)基因手段，混合攜帶重組酶Cre的腺相關(guān)病毒AAV1-Cre-GFP和

13、AAV8-hM3Dq-mCherry皮質(zhì)注射。Cre酶可以敲除Ptenfl/fl小鼠的Pten基因，同時(shí)在N-氧化氯氮平（CNO）的出現(xiàn)下提高神經(jīng)活動(dòng)；使用免疫熒光法觀察皮質(zhì)mTOR通路的激活情況和神經(jīng)活動(dòng)的提高情況；觀察CST的軸突再生情況；行為學(xué)檢測(cè)SCI小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
　　主要結(jié)果：
　　1、C5脊髓鉗夾損傷主要引起動(dòng)物上肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能的持久障礙，相比對(duì)照組差異明顯，P＜0.05;該模型對(duì)動(dòng)物下肢的步行活動(dòng)影響較

14、小，動(dòng)物一般情況較好；皮質(zhì)脊髓束（CST）和紅核脊髓束（RST）均因損傷而斷裂，即使等到SCI后八周仍然沒(méi)有任何再生的跡象，軸突回撤（Retraction or Die back）現(xiàn)象明顯；SCI后局部再生抑制蛋白Nogo-A、MAG、CSPGs等表達(dá)明顯上調(diào)，P＜0.05，星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯，表達(dá)相應(yīng)蛋白增多，P＜0.05；SCI后皮質(zhì)和紅核神經(jīng)元mTOR活性水平明顯下降，相比sham組差異明顯，P＜0.05。
　　2

15、、成功建立皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系并合成 PTEN降解肽（Degron）；PTEN Degron干預(yù)4小時(shí)神經(jīng)元PTEN蛋白便被有效的敲減，P＜0.05，這種現(xiàn)象持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)，且能被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷；PTEN Degron能有效促進(jìn)DRG神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，提高神經(jīng)元p-S6表達(dá)水平, P＜0.05，MG132或雷帕霉素能阻斷PTEN Degron的作用；在CSPGs抑制性微環(huán)境中，PTEN Degron同樣能促進(jìn)DRG生

16、長(zhǎng), P＜0.05。
　　3、PTEN Degron皮質(zhì)注射后4小時(shí)便引起皮質(zhì)神經(jīng)元p-S6表達(dá)增加，這種現(xiàn)象持續(xù)在注射后3天消失；PTEN Degron注射引起一過(guò)性的皮質(zhì)Iba-1膠質(zhì)激活和NeuN表達(dá)下調(diào)；PTEN Degron30μg/d的持續(xù)微量泵泵入同樣能激活皮質(zhì)神經(jīng)元mTOR活性；PTEN Dgron泵入能促進(jìn)泵入側(cè)CST的出芽再生，緩解軸突回撤，P＜0.05；PTEN Degron對(duì)病灶遠(yuǎn)端的軸突再生沒(méi)有明顯的促進(jìn)

17、作用,P＞0.05；PTEN Degron對(duì)SCI小鼠的上肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)沒(méi)有明顯促進(jìn)作用, P＞0.05。
　　4、單獨(dú)敲除Pten或提高神經(jīng)活動(dòng)對(duì)CST軸突再生都有促進(jìn)作用，若將二者聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)SCI后軸突再生的刺激作用更強(qiáng),P＜0.05；聯(lián)合mTOR和刺激神經(jīng)活動(dòng)有利于動(dòng)物上肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù), P＜0.05。
　　主要結(jié)論：
　　1、C5脊髓鉗夾與臨床相關(guān)性密切，適合作為軸突再生的研究模型，且可以進(jìn)行與CS

18、T再生相關(guān)的隨意運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)。SCI不僅引起局部抑制性微環(huán)境的形成，還導(dǎo)致神經(jīng)元軸突內(nèi)源性再生能力下降。
　　2、PTEN Degron能快速敲減培養(yǎng)神經(jīng)元PTEN蛋白，激活mTOR通路，促進(jìn)DRG突起的生長(zhǎng)。PTEN Degron發(fā)揮作用的機(jī)制和蛋白酶體功能及mTOR通路有關(guān)。
　　3、PTEN Degron體內(nèi)應(yīng)用同樣能快速激活mTOR通路，發(fā)揮有限的促進(jìn)軸突出芽再生的作用。PTEN Degron側(cè)腦室泵入兩周不足以促進(jìn)