干細胞參與胰腺炎損傷修復實驗研究.pdf

1、一、研究背景
　　 急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急腹癥，臨床經(jīng)過復雜、變化迅速、其中約10～20％的患者發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。SAP 死亡率高，預后欠佳，死亡率高達15～20％，特別是早期重癥胰腺炎(early severe acutepancreatitis，ESAP)合并多臟器功能障礙綜合征(MODS)死亡率更高。急性重癥胰

2、腺炎被認為本世紀尚待攻克的生命科學的一大難題。
　　 如何遏制重癥胰腺炎的進行性惡化，促進胰腺損傷的快速修復，近年來，學術界對胰腺炎的發(fā)病機制及相應治療進行了大量的研究和深入探討，取得了一定成果，但至今還未能夠?qū)@個病理過程作出一個完整的、滿意的解釋。上世紀末、本世紀初，隨著干細胞研究逐漸成為熱點，胰干細胞參與胰腺損傷修復也備受人們關注。
　　 干細胞（stem cell）為一類不分化而長期生存且保持多種分化潛能的細胞群

3、；祖細胞（progenitor cell）為一類分化能力、自我更新、自我維持能力受限制，只有單向或雙向分化潛能且生存時間相對較短的細胞群。目前，圍繞著干細胞參與胰腺組織的損傷修復主要存在的爭論：（1）成體胰腺組織內(nèi)是否存在胰干細胞？（2）胰干細胞的來源和存在的部位；（3）胰干細胞參與胰腺修復的主要方式和機制。有學者認為成體胰腺組織內(nèi)原位干細胞可能存在于胰島、胰腺導管和腺泡上皮。然而也有學者對胰腺組織內(nèi)存在原位干細胞的觀點提出質(zhì)疑，指出所

4、謂胰腺干細胞實際來自骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchyme stem cells MSCs）。
　　 成體胰腺組織內(nèi)是否存在原位干細胞？胰腺損傷時，組織內(nèi)必然伴隨有膠原纖維的增生、沉積，干細胞又如何在這種情況下參與組織的損傷修復？我們擬建立大鼠急性胰腺炎動物模型，并對腺泡細胞凋亡進行調(diào)控，進一步觀察損傷組織膠原的形成和胰干細胞參與組織修復的過程。
　　 二、目的
　　 本實驗通過建立大鼠急性胰腺炎模

5、型，擬行如下內(nèi)容探討：（1）大鼠急性胰腺炎的自然病理演變規(guī)律；（2）胰腺炎病理過程中腺泡細胞凋亡演變規(guī)律及地塞米松對細胞凋亡的影響；（3）通過對胰腺干細胞特異性抗原進行免疫組化染色，探討胰干細胞在成體胰腺組織內(nèi)的定位及參與修復時的遷移規(guī)律，同時通過realtime-PCR（RT-PCR）技術對不同時段PDX-1mRNA 予以實時定量，從基因角度探討關鍵因子PDX-1對胰干細胞參與損傷修復時的調(diào)控作用；（4）通過對5-溴-2’脫氧脲嘧啶核

6、苷（Brdu）這一特異性細胞增殖抗原進行免疫染色，探討干細胞參與修復時的增殖規(guī)律；（5）探討Ⅰ型膠原在胰腺損傷時組織內(nèi)的分布規(guī)律，并對其重要調(diào)控基因TGF-β1mRNA進行RT-PCR定量分析，探討TGF-β1對Ⅰ型膠原合成的調(diào)控作用。通過這一課題研究，我們擬初步闡明胰干細胞在胰腺組織中的定位，并進一步闡明胰腺泡細胞凋亡和胰干細胞在胰腺急性損傷修復中的作用，為急性胰腺炎的治療從細胞學角度開辟一條新的途徑。
　　 三、方法

7、　　 （一）分組及操作方法清潔級SD大鼠84只，隨機分對照組24只、實驗組30只和干預組30只，各組再隨機分為6個亞組，各亞組分別為4、5、5只。（1）實驗組和干預組予以雨蛙素腹腔注射行急性胰腺炎造模，50ug/Kg 體重，1次/h，連續(xù)4次；（2）對照組于同一時間點腹腔注射生理鹽水0.5ml；（3）干預組腹腔注射地塞米松0.5mg/kg，1次/d；（4）三組分別于造模后6h、1d、2d、3 d、5 d、7d 各處死一個亞組；（5）處

8、死前6、3 h分別腹腔內(nèi)注射Brdu 標記胰腺增值細胞，100mg/kg 體重。
　　 （二）手術方法乙醚吸入麻醉，打開腹腔，觀察腹腔內(nèi)各臟器及腹水情況；心尖部穿刺抽血 2～4ml，備淀粉酶檢測；取胰腺中部組織約200μg，液氮灌內(nèi)保存，備PCR 檢測；取胰腺中部組織約500mg，甲醛溶液中固定，備HE 染色、凋亡及免疫組化檢測。
　　 （三）檢查項目及方法（1）自動生化系統(tǒng)檢測血清淀粉酶；（2）常規(guī)HE 染色觀察胰腺組

9、織的病理變化；
　　 （3）按凋亡試劑盒說明行胰腺組織凋亡細胞的檢測；（4）免疫組化方法觀察胰腺干細胞標志物Nestin、C-kit蛋白和細胞增值蛋白Brdu的表達情況，并觀察Ⅰ型膠原在胰腺組織內(nèi)的分布規(guī)律；（5）RT-PCR 方法檢測胰干細胞重要調(diào)節(jié)因子胰腺十二指腸同源盒1(PDX-1)基因不同時段的表達量；（6）RT-PCR 方法檢測Ⅰ型膠原的重要調(diào)控因子不同時段TGF-β1的表達量。
　　 三、結論：
　　

10、 （一）腺泡細胞凋亡是胰腺炎發(fā)生后的又一瀑布鏈式反應，是胰腺組織的一種自我防護反應，伴隨急性胰腺炎病理全程，以胰腺炎早期最為明顯；病理早期的空泡結構很可能是腺泡細胞凋亡后的殘留空間；地塞米松對腺泡細胞的凋亡沒有明顯的促進作用。
　　 （二）鑒于腺泡細胞凋亡在胰腺炎病理過程中的重要作用和地位，可將傳統(tǒng)胰腺炎的病理分期更改，即水腫凋亡期、出血壞死期、愈合期三期，這樣更有助于對胰腺炎病理轉(zhuǎn)歸的理解。
　　 （三）成體胰腺組織內(nèi)