干細(xì)胞參與胰腺炎損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景
　　 急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥，臨床經(jīng)過(guò)復(fù)雜、變化迅速、其中約10～20％的患者發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。SAP 死亡率高，預(yù)后欠佳，死亡率高達(dá)15～20％，特別是早期重癥胰腺炎(early severe acutepancreatitis，ESAP)合并多臟器功能障礙綜合征(MODS)死亡率更高。急性重癥胰

2、腺炎被認(rèn)為本世紀(jì)尚待攻克的生命科學(xué)的一大難題。
　　 如何遏制重癥胰腺炎的進(jìn)行性惡化，促進(jìn)胰腺損傷的快速修復(fù)，近年來(lái)，學(xué)術(shù)界對(duì)胰腺炎的發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)治療進(jìn)行了大量的研究和深入探討，取得了一定成果，但至今還未能夠?qū)@個(gè)病理過(guò)程作出一個(gè)完整的、滿意的解釋。上世紀(jì)末、本世紀(jì)初，隨著干細(xì)胞研究逐漸成為熱點(diǎn)，胰干細(xì)胞參與胰腺損傷修復(fù)也備受人們關(guān)注。
　　 干細(xì)胞（stem cell）為一類(lèi)不分化而長(zhǎng)期生存且保持多種分化潛能的細(xì)胞群

3、；祖細(xì)胞（progenitor cell）為一類(lèi)分化能力、自我更新、自我維持能力受限制，只有單向或雙向分化潛能且生存時(shí)間相對(duì)較短的細(xì)胞群。目前，圍繞著干細(xì)胞參與胰腺組織的損傷修復(fù)主要存在的爭(zhēng)論：（1）成體胰腺組織內(nèi)是否存在胰干細(xì)胞？（2）胰干細(xì)胞的來(lái)源和存在的部位；（3）胰干細(xì)胞參與胰腺修復(fù)的主要方式和機(jī)制。有學(xué)者認(rèn)為成體胰腺組織內(nèi)原位干細(xì)胞可能存在于胰島、胰腺導(dǎo)管和腺泡上皮。然而也有學(xué)者對(duì)胰腺組織內(nèi)存在原位干細(xì)胞的觀點(diǎn)提出質(zhì)疑，指出所

4、謂胰腺干細(xì)胞實(shí)際來(lái)自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchyme stem cells MSCs）。
　　 成體胰腺組織內(nèi)是否存在原位干細(xì)胞？胰腺損傷時(shí)，組織內(nèi)必然伴隨有膠原纖維的增生、沉積，干細(xì)胞又如何在這種情況下參與組織的損傷修復(fù)？我們擬建立大鼠急性胰腺炎動(dòng)物模型，并對(duì)腺泡細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步觀察損傷組織膠原的形成和胰干細(xì)胞參與組織修復(fù)的過(guò)程。
　　 二、目的
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠急性胰腺炎模

5、型，擬行如下內(nèi)容探討：（1）大鼠急性胰腺炎的自然病理演變規(guī)律；（2）胰腺炎病理過(guò)程中腺泡細(xì)胞凋亡演變規(guī)律及地塞米松對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；（3）通過(guò)對(duì)胰腺干細(xì)胞特異性抗原進(jìn)行免疫組化染色，探討胰干細(xì)胞在成體胰腺組織內(nèi)的定位及參與修復(fù)時(shí)的遷移規(guī)律，同時(shí)通過(guò)realtime-PCR（RT-PCR）技術(shù)對(duì)不同時(shí)段PDX-1mRNA 予以實(shí)時(shí)定量，從基因角度探討關(guān)鍵因子PDX-1對(duì)胰干細(xì)胞參與損傷修復(fù)時(shí)的調(diào)控作用；（4）通過(guò)對(duì)5-溴-2’脫氧脲嘧啶核

6、苷（Brdu）這一特異性細(xì)胞增殖抗原進(jìn)行免疫染色，探討干細(xì)胞參與修復(fù)時(shí)的增殖規(guī)律；（5）探討Ⅰ型膠原在胰腺損傷時(shí)組織內(nèi)的分布規(guī)律，并對(duì)其重要調(diào)控基因TGF-β1mRNA進(jìn)行RT-PCR定量分析，探討TGF-β1對(duì)Ⅰ型膠原合成的調(diào)控作用。通過(guò)這一課題研究，我們擬初步闡明胰干細(xì)胞在胰腺組織中的定位，并進(jìn)一步闡明胰腺泡細(xì)胞凋亡和胰干細(xì)胞在胰腺急性損傷修復(fù)中的作用，為急性胰腺炎的治療從細(xì)胞學(xué)角度開(kāi)辟一條新的途徑。
　　 三、方法

7、　　 （一）分組及操作方法清潔級(jí)SD大鼠84只，隨機(jī)分對(duì)照組24只、實(shí)驗(yàn)組30只和干預(yù)組30只，各組再隨機(jī)分為6個(gè)亞組，各亞組分別為4、5、5只。（1）實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組予以雨蛙素腹腔注射行急性胰腺炎造模，50ug/Kg 體重，1次/h，連續(xù)4次；（2）對(duì)照組于同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射生理鹽水0.5ml；（3）干預(yù)組腹腔注射地塞米松0.5mg/kg，1次/d；（4）三組分別于造模后6h、1d、2d、3 d、5 d、7d 各處死一個(gè)亞組；（5）處

8、死前6、3 h分別腹腔內(nèi)注射Brdu 標(biāo)記胰腺增值細(xì)胞，100mg/kg 體重。
　　 （二）手術(shù)方法乙醚吸入麻醉，打開(kāi)腹腔，觀察腹腔內(nèi)各臟器及腹水情況；心尖部穿刺抽血 2～4ml，備淀粉酶檢測(cè)；取胰腺中部組織約200μg，液氮灌內(nèi)保存，備PCR 檢測(cè)；取胰腺中部組織約500mg，甲醛溶液中固定，備HE 染色、凋亡及免疫組化檢測(cè)。
　　 （三）檢查項(xiàng)目及方法（1）自動(dòng)生化系統(tǒng)檢測(cè)血清淀粉酶；（2）常規(guī)HE 染色觀察胰腺組

9、織的病理變化；
　　 （3）按凋亡試劑盒說(shuō)明行胰腺組織凋亡細(xì)胞的檢測(cè)；（4）免疫組化方法觀察胰腺干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、C-kit蛋白和細(xì)胞增值蛋白Brdu的表達(dá)情況，并觀察Ⅰ型膠原在胰腺組織內(nèi)的分布規(guī)律；（5）RT-PCR 方法檢測(cè)胰干細(xì)胞重要調(diào)節(jié)因子胰腺十二指腸同源盒1(PDX-1)基因不同時(shí)段的表達(dá)量；（6）RT-PCR 方法檢測(cè)Ⅰ型膠原的重要調(diào)控因子不同時(shí)段TGF-β1的表達(dá)量。
　　 三、結(jié)論：
　　

10、 （一）腺泡細(xì)胞凋亡是胰腺炎發(fā)生后的又一瀑布鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是胰腺組織的一種自我防護(hù)反應(yīng)，伴隨急性胰腺炎病理全程，以胰腺炎早期最為明顯；病理早期的空泡結(jié)構(gòu)很可能是腺泡細(xì)胞凋亡后的殘留空間；地塞米松對(duì)腺泡細(xì)胞的凋亡沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。
　　 （二）鑒于腺泡細(xì)胞凋亡在胰腺炎病理過(guò)程中的重要作用和地位，可將傳統(tǒng)胰腺炎的病理分期更改，即水腫凋亡期、出血壞死期、愈合期三期，這樣更有助于對(duì)胰腺炎病理轉(zhuǎn)歸的理解。
　　 （三）成體胰腺組織內(nèi)