骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠重癥急性胰腺炎相關(guān)肺損傷保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　 1、建立重癥急性胰腺炎相關(guān)肺損傷的動物模型，了解大鼠肺功能受損后的病理改變。
　　 2、建立一種分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增，熒光標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法，為利用MSCs進(jìn)行肺損傷的細(xì)胞治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　 3、通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肺損傷的大鼠，評價其對大鼠肺功能的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1、采用改進(jìn)的膽胰管逆行注射?；悄懰徕c造成大鼠急性出血壞死型胰腺炎（AHNP）模型

2、，將大鼠分為2組，SAP組健康雄性SD大鼠，250g～350g，氯胺酮麻醉并固定大鼠，于腹前正中線開腹，分層剪開皮毛、腹肌暴露十二指腸，提起十二指腸,顯露肝門部,沿膽總管主干尋找至匯入十二指腸處，縫扎膽胰管末端進(jìn)入十二指腸處,5 min后,見膽胰管均較前充盈,乃以動脈夾鉗夾肝總管近側(cè)端,于主胰管進(jìn)入十二指腸處的對側(cè)腸壁,向肝門方向以4 ＃ 針頭穿刺膽管,緩慢推入?；悄懰徕c(速度為0.2 ml/min)，劑量為1ml/kg。對照組大鼠僅作

3、假手術(shù)。
　　 2、差異貼壁法獲得MSCs：用DMEM-F12不斷沖洗SD大鼠的股骨和脛骨的骨端。抽取相對密度1.073 g/mL的Ficoll分離液，將沖洗下的細(xì)胞懸液混合分離液，2500rpm離心25min，棄去上清液，用含10％～15％胎牛血清培養(yǎng)液重懸后，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，在37℃，5％ CO2，飽和濕度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24小時后沒有貼壁的細(xì)胞被丟棄。每星期兩次的跟換細(xì)胞培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長、貼壁情況。細(xì)胞生長

4、至培養(yǎng)瓶面積約90％時傳代，根據(jù)細(xì)胞生長情況1：2。傳至第3代時，胰酶消化，收獲細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。
　　 獲取雄性SD大鼠的MSCs，傳代、增殖、純化。將第3代MSCs用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）標(biāo)記，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記率。再將MSCs制成細(xì)胞懸液，濃度為1×106/ml，于造模前1h，通過尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)，1ml/只。
　　 3、對照組尾靜脈注射等量生理鹽水。于輸注后1h、3h、6h、12h、24h

5、分批處死大鼠，獲取血液、肺組織等標(biāo)本。檢測血液IL-1β、IL-10、TNF-α、MIP-α、AYM的濃度。肺組織部分行快速冰凍，熒光顯微鏡下觀察DAPI陽性細(xì)胞；部分常規(guī)HE染色，觀察肺組織受損情況。實時定量PCR測定肺組織TNF-α、SP量的測定。
　　 結(jié)果：
　　 1、對照組大鼠血清淀粉酶水平1468±105.5U/L。造模組大鼠在造模后3小時起，血淀粉酶水平顯著升高，至12小時達(dá)到高峰10249±1392U/L

6、。顯微鏡下觀察對照組胰腺組織結(jié)果清晰，間質(zhì)無滲出。病理評分為0.14±0.12。造模組病理評分顯示12h達(dá)到頂點。顯微鏡下觀察，造模12h可見間質(zhì)明顯水腫、大量中性粒細(xì)胞浸潤。病理評分為6.68±0.64。造模組3、6、12h肺通透性指數(shù)、濕干比值均高于對照組。
　　 2、顯微鏡觀察原代接種48h即可見很多細(xì)胞貼壁，外觀呈多角形， 72h后細(xì)胞數(shù)量貼壁開始增多，細(xì)胞形態(tài)呈成短小纖維細(xì)胞樣長梭形，培養(yǎng)至8d左右細(xì)胞匯合達(dá)到90％左

7、右，細(xì)胞呈極性排列，集落呈漩渦狀。經(jīng)過換液和傳代后，MSC細(xì)胞逐漸純化，傳至第3代時，細(xì)胞形態(tài)比較均一，呈膜狀鋪展。
　　 3、MSCs組比SAP組血清的淀粉酶有顯著下降并在12小時達(dá)到高峰.濕干比值是高提示肺水腫的存在，MSCs組比SAP組的濕干比明顯下降。蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組（SO組）的肺泡組織結(jié)構(gòu)正常，SAP組肺組織出現(xiàn)肺損傷改變。MSCs組的肺組織病理變化較輕。PCR測定顯示在干細(xì)胞治療組中的TNF-α、S

8、P的量明顯低于SAP組。
　　 結(jié)論：
　　 1、?；悄懰徕c膽胰管逆行注射造成AHNP模型大鼠于術(shù)后6H即出現(xiàn)明顯的肺損傷表現(xiàn)，符合PALI病理改變，與臨床SAP合并急性肺損傷（ALI）的病理過程相似，可作為研究SAP合并肺損傷的模型。
　　 2、全骨髓差異貼壁法能夠獲得較高純度的MSCs，為后續(xù)實驗提供了充足的MSCs來源。
　　 3、重癥急性胰腺炎能夠引起大鼠全身性炎癥反應(yīng)，移植的MSCs能夠遷移并定