骨髓間充質(zhì)干細胞的制備與對實驗性重癥急性胰腺炎作用的研究.pdf

1、本課題以急性胰腺炎模型大鼠為研究對象,觀察急性胰腺炎病程中MSCs功能變化情況,進而通過預(yù)先骨髓干預(yù)方法,研究骨髓功能狀態(tài)對SAP病情的影響,并給予SAP雌性模型大鼠輸注同種屬雄性來源MSCs,觀察移植MSCs在體“歸巢”、遷移、定植、分化情況,明確MSCs在急性胰腺炎組織損傷修復(fù)中的作用及其機制。 第一部分 SAP和MAP動物模型制作及評估 目的：制作SAP和MAP動物模型,造模后不同時間點檢測胰腺炎相關(guān)評價指標,初步

2、了解大鼠SAP模型病程規(guī)律,為下步實驗選取關(guān)鍵時間點。 方法:SAP模型制作,雄性SD大鼠,體重250-300g。無菌條件下,以3％戊巴比妥鈉,按30mg/kg劑量腹腔注射麻醉并固定大鼠。于劍突下約3cm處腹壁正中,分層剪開皮毛、腹肌。循胃、十二指腸球及降部,暴露胰腺區(qū)域,找到主胰管,以24G靜脈套管針于主胰管對側(cè)腸壁刺入腸腔,稍退出針芯,循乳頭將軟套管穿入主胰膽管約0.5cm,動脈夾固定,另于主胰膽管上游近肝門處動脈夾鉗夾。3

3、％牛磺膽酸鈉溶液30mg/kg,以微泵12ml/h速度注入。注射后拔除套管針。為保證模型制作穩(wěn)定,將?；悄懰徕c溶液中加入美蘭溶液1滴,注射成功時可清晰顯示胰管走行,并且藍色溶液未漏入腸腔。輕癥急性胰腺炎(MAP)模型制作,雨蛙素20ug/kg,腹腔注射,間隔1h-次,連續(xù)4次,在第一次注射后12小時造模成功。對照組大鼠僅進行假手術(shù)。在造模后0.5h、2h、4h、8h、12h、24h處死動物,檢測血清淀粉酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血肌酐,獲取

4、胰腺病理組織,依據(jù)schmidt評分法進行評分。觀察72h三組動物存活情況。 結(jié)論：雨蛙素腹腔注射和?；悄懰徕c胰管內(nèi)逆行注射分別可以誘導(dǎo)MAP和SAP動物模型,方法成熟,模型穩(wěn)定。該SAP模型組織損傷嚴重,動物死亡率高,適合作為胰腺炎治療研究對象,SAP 24h模型動物胰腺病理損害最為嚴重,死亡率和病情達到高峰,在后面實驗中,我們選擇24h為SAP模型主要觀測時間點和干預(yù)治療時間點。 第二部分 MSCs原代、傳代培養(yǎng)及鑒

5、定 目的：原代培養(yǎng)并純化MSCs,根據(jù)細胞表面標志物及其分化能力對MSCs進行功能鑒定,為下步實驗制備MSCs產(chǎn)品。 方法：無菌條件下,剪除大鼠雙側(cè)下肢,分離股骨,超凈臺上剪開骨端,10％胎牛反復(fù)沖洗髓腔至骨干發(fā)白,800rpm離心5分鐘,棄上清,按5×105/cm2密度接種于含10％胎牛的DMEM+F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24h內(nèi)觀察細胞貼壁情況,此后每12h觀察細胞貼壁情況,待細胞生長至培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板而積80％時傳代,根

6、據(jù)細胞生長情況1:2,1:3傳代。首次傳代后繼續(xù)定期觀察,傳代。傳至第三代時,胰酶消化,收獲細胞,并計數(shù)。分別進行流式檢測和誘導(dǎo)分化研究。流式檢測方法,將收獲的MSCs分入5個離心管,每管約105細胞,分別為空白、CD29單標管、CD44單標管、CD45單標管、mix管,各管內(nèi)加入相應(yīng)標記抗體,避光孵育20分鐘后上機檢測。誘導(dǎo)分化方法,分別將P3代以上MSCs加入成骨、成脂、成軟骨體系貼壁培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)2周后行茜素紅染色,觀察鈣結(jié)節(jié)染色

7、,成脂誘導(dǎo)1周后行油紅染色,觀察脂肪顆粒染色,成軟骨誘導(dǎo)3周后行II型膠原免疫組化染色并觀察。對照組以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時間后,按照同樣方法染色。 結(jié)論：本部分實驗建立了穩(wěn)定的MSCs原代、傳代培養(yǎng)方法。獲得的MSCs經(jīng)貼壁傳代培養(yǎng),純度達95％以上,流式鑒定結(jié)果顯示為Lin-CD29+CD44+-CD45-細胞群。通過對該細胞群進行三系誘導(dǎo)分化,結(jié)果顯示,MSCs可以向三系分化,為下部分實驗提供了充足的MSCs產(chǎn)品。

8、第三部分 SAP時MSCs功能狀態(tài)分析 目的：分析SAP不同時間段內(nèi)MSCs功能狀態(tài)情況。 方法：胰管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c法制作SAP動物模型(方法同第一部分),在造模后12h、24h、36h處死動物,獲取動物骨髓細胞,離心后棄上清,按105/cm2密度接種于含10％胎牛的DMEM+F12培養(yǎng)基的24孔板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24h內(nèi)觀察細胞貼壁情況,此后每12h觀察細胞貼壁情況,待細胞生長至80％時傳代,根據(jù)細胞生長情況1:

9、2,1:3傳代。首次傳代后繼續(xù)定期觀察,傳代。傳至第三代時,胰酶消化,收獲細胞,應(yīng)用流式細胞儀進行檢測(方法同第二部分)。平板克隆法計算克隆形成率,獲取動物骨髓細胞,按105cm2密度接種于24孔板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),連續(xù)觀察,至出現(xiàn)肉眼可見細胞集落,棄除培養(yǎng)基,PBS沖洗,結(jié)晶紫染色10-15分鐘,流水沖洗,計算肉眼可見克隆集落數(shù)目。分化能力分析,P3代以上MSCs胰酶消化收獲后,分別加入成骨、成脂、成軟骨體系貼壁培養(yǎng),誘導(dǎo)分化(方法同第

10、二部分)。對照組大鼠未行胰腺炎造模,僅進行假手術(shù),檢測分析方法同上。 結(jié)論：在SAP不同時間段,MSCs數(shù)量和增殖能力發(fā)生了改變,可能經(jīng)歷了先增加,再減少的過程。盡管MSCs增殖能力改變,SAP大鼠骨髓MSCs表面CD29、CD44、CD45表達無明顯變化。SAP時MSCs具有三系分化潛力。SAP病程對MSCs功能產(chǎn)生影響,增殖的MSCs可能參與了SAP病程。 第四部分 骨髓干預(yù)處理對SAP病情的影響 目的：觀察

11、骨髓動員及骨髓抑制預(yù)處理對SAP病情的影響。 方法：實驗動物為雄性SD大鼠,按照隨機數(shù)字法分入正常對照組、骨髓抑制組(busulfan)、骨髓動員組(G-CSF)、SAP組、骨髓抑制-SAP組(busulfan-SAP),骨髓動員-SAP組(G-CSF-SAP)。骨髓動員處理以中性粒細胞集落刺激因子(G-CSF),100μg/kg,腹腔內(nèi)注射,2h后胰管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c法制作骨髓動員-SAP模型。骨髓抑制處理以白消安注射液,

12、1mg/100g,腹腔內(nèi)注射,6h后胰管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c法制作骨髓抑制-SAP模型。對照組為未進行骨髓干預(yù)的健康SD大鼠。骨髓抑制組和骨髓動員組在骨髓干預(yù)后2h,獲取動物血液標本,檢測血淀粉酶,制作血涂片,獲取胰腺組織標本,HE染色后進行病理評分,取雙側(cè)股骨,制作骨髓涂片。血涂片和骨髓涂片進行瑞氏-姬姆薩染色,油鏡下觀測,對有核細胞計數(shù)。骨髓干預(yù)-SAP模型在SAP造模后12h,處死動物,檢測血清淀粉酶,獲取胰腺病理組織,依據(jù)sch

13、midt評分法進行評分。觀察72h三組動物存活情況。 結(jié)論:G-CSF、白消安注射液分別能夠動員或抑制大鼠骨髓MSCs。骨髓抑制-SAP組大鼠72h生存率顯著下降。提示MSCs功能狀態(tài)與SAP病情相關(guān),MSCs可能在SAP時發(fā)揮保護作用,促進損傷修復(fù)。 第五部分 同種異體MSCs移植對SAP的治療作用及其機制 目的：觀察MSCs移植對SAP的治療作用,進而初步探討其機制。 方法：獲取雄性SD大鼠MSCs,

14、傳代培養(yǎng)(方法同第二部分)。制作雌性SD大鼠SAP動物模型(方法同第一部分)。造模后24h輸注P3代以上MSCs,約5-7×107/只。輸注后24h處死動物,獲取血液、骨髓、胰腺、肺臟、肘臟、脾臟、心臟、腎臟等病理標本。MSCs在體鑒定,抽提臟器組織DNA,PCR法檢測Y染色體sry片段。MSCs熒光標記在體鑒定,獲取MSCs細胞懸液,約107/ml,CFSE染液染色,37℃孵育5分鐘,熒光顯微鏡觀察后輸注SAP大鼠。輸注治療24h后獲

15、取上述標本,血液標本經(jīng)紅細胞裂解液處理,流式檢測CFSE陽性細胞。骨髓懸液熒光顯微鏡下觀察。組織標本行HE染色或免疫組化染色后熒光顯微鏡下觀察。抽提胰腺組織、肺臟組織RNA,SYBERGREEN法相對實時定量RT-PCR檢測TNF-α,IL-1βmRNA表達。免疫組化法檢測MSCs爬片標本、SAP未輸注治療組胰腺病理切片、輸注治療后胰腺病理切片SHH抗原表達。輸注治療后胰腺病理切片免疫熒光檢測SHH、CFSE染色雙標記陽性細胞,檢測CK

16、19、CFSE染色雙標記陽性細胞。觀察輸注治療組和SAP未輸注治療組72h生存情況。 結(jié)論:MSCs移植治療可以降低SAP模型大鼠胰腺、肺臟TNF-α,IL-1βmRNA表達水平,提高SAP模型大鼠生存率。移植的MSCs可以“歸巢”至骨髓,遷移至胰腺炎癥損傷部位。貼壁培養(yǎng)MSCs和未經(jīng)治療的胰腺炎組織不表達SHH,輸注治療后,胰腺炎組織SHH表達陽性,并且存在SHH、CFSE陽性暈疊區(qū)域。提示SHH參與了MSCs遷移或分化過程。

17、 全文小結(jié)：本課題采用胰管內(nèi)注射牛磺膽酸鈉法,成功制作實驗性SAP大鼠模型,通過對SAP病情指標評估,確定24h為治療干預(yù)時間點。應(yīng)用貼壁法,對正常狀態(tài)和SAP狀態(tài)MSCs進行原代和傳代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)SAP不同階段MSCs數(shù)量和增殖能力經(jīng)歷了先升高再降低的過程。應(yīng)用骨髓干預(yù)措施改變MSCs功能狀態(tài),結(jié)果顯示MSCs抑制的SAP大鼠病情加重,死亡率提高,提示MSCs在SAP時可能發(fā)揮保護作用。進而應(yīng)用同種異體MSCs移植治療SAP,提