阿奇霉素干預(yù)阿霉素腎病大鼠基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、目的：
　　通過觀察阿奇霉素（Azithromycin，AZM）對(duì)阿霉素腎病(Adriamycin-induced nephropathy，ADN)大鼠血、尿生化指標(biāo)，腎組織基因表達(dá)譜的影響，從基因水平上探討阿霉素腎病的發(fā)病機(jī)制及阿奇霉素干預(yù)阿霉素腎病的機(jī)制。
　　方法：
　　135只健康雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為空白組（A組）、模型組（B組）、阿奇霉素組（C組）、潑尼松組（D組）及聯(lián)合組（E組）

2、，每組27只。除空白組外，其余四組大鼠采用間隔1周2次尾靜脈注射阿霉素法（第1次注射4mg/kg，1周后第2次注射3.5mg/kg）建立阿霉素腎病大鼠模型，空白組同期注射同等劑量的生理鹽水。于實(shí)驗(yàn)第5周起，每日早晨給予阿奇霉素組、潑尼松組、聯(lián)合組相應(yīng)的干預(yù)藥物配成水溶液灌胃，其余兩組同期給予等劑量生理鹽水灌胃，各組大鼠均自由飲水及攝食基礎(chǔ)飼料。連續(xù)灌胃4周。測定各組大鼠第4周、6周、8周的24小時(shí)尿蛋白（24hUPro）排泄量、尿肌酐（

3、Ucr）及血生化指標(biāo)，包括血清總蛋白(Tp)、白蛋白(Alb)、膽固醇（Tcho）、血肌酐（Scr），計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）。應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)血、尿生化指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用Agilent公司生產(chǎn)的Agilent SurePrint G3 Rat Gene Expression（8×60k）基因芯片檢測第8周時(shí)各組大鼠的腎臟基因表達(dá)譜，并利用Gene Ontology富集分析和Pathway信號(hào)通路分析等

4、生物信息學(xué)方法對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.五組大鼠24h尿蛋白定量及血生化結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)第4周，B組、C組、D組和E組24hUPro＞100mg/d，提示造模成功，并且四組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.1相同時(shí)間點(diǎn)A、B、C、D、E組之間血、尿生化指標(biāo)的比較
　　實(shí)驗(yàn)第4周，B組、C組D組和E組較A組24hUPro、Scr、Tcho明顯升高（P＜0.05）， Tp、Alb及Ccr明顯降低（P

5、＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)第6周和第8周， C組、D組和E組24hUPro、Scr及Tcho明顯低于B組（P＜0.05），Tp、Alb及Ccr明顯高于B組（P＜0.05）。D組、E組24hUPro、Scr及Tcho低于C組（P＜0.05），Tp、Alb及Ccr高于C組（P＜0.05）。E組24hUPro、Scr及Tcho低于D組，Tp、Alb及Ccr高于D組（P＜0.05）。
　　1.2 A、B、C、D、E組不同時(shí)間點(diǎn)血、尿生

6、化指標(biāo)的比較
　　A組4、6、8周各指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　B組第6周24hUPro、Scr及Tcho明顯高于第4周（P＜0.05），Tp、Alb及Ccr明顯低于第4周（P＜0.05）。第8周24hUPro、Scr及Tcho明顯高于第4周（P＜0.05）、第6周（P＜0.05），Tp、Alb及Ccr明顯低于第4周（P＜0.05）、第6周（P＜0.05）。
　　C、D、E組第6周24hUPro、Scr及Tcho明

7、顯低于各自第4周（P＜0.05），Tp、Alb及Ccr明顯高于各自第4周（P＜0.05）。各組第8周24hUPro、Scr及Tcho明顯低于第4周（P＜0.05）、第6周（P＜0.05），Tp、Alb及Ccr明顯高于第4周（P＜0.05）、第6周（P＜0.05）。
　　2.總RNA質(zhì)檢結(jié)果利用 QIAGEN RNeasy Mini Kit純化所有樣本總RNA后，用NanoDrop分光光度計(jì)及Agilent2100 Bioanaly

8、zer對(duì)樣本總RNA的完整性及純度進(jìn)行定性和定量檢測，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所取樣本經(jīng)檢測均達(dá)到RIN≥7.0，28S/18S＞0.7且A260/A280吸收率為1.9-2.2，提示總RNA的純度及完整性達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，可以進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)。
　　3.差異基因篩選結(jié)果
　　芯片雜交數(shù)據(jù)經(jīng)后期處理及分析發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組共有185個(gè)基因發(fā)生差異性表達(dá)，經(jīng)Gene Ontology富集分析，上述差異表達(dá)的基因主要涉及的生物學(xué)過程有

9、細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)等，經(jīng)Pathway信號(hào)通路分析，上述差異表達(dá)的基因涉及的信號(hào)通路有p53信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路等；而與模型組相比，阿奇霉素組共有824個(gè)基因發(fā)生差異性表達(dá)，經(jīng)Gene Ontology富集分析，上述差異表達(dá)的基因主要涉及的生物學(xué)過程包括上皮細(xì)胞的分化、脂肪酸代謝、損傷修復(fù)、吞噬作用的調(diào)節(jié)等，經(jīng)Pathway信號(hào)通路分析，上述差異表達(dá)的基因涉及的信號(hào)通路有P

10、PAR-γ信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等；與模型組相比，潑尼松組共有749個(gè)基因發(fā)生差異性表達(dá)，經(jīng)Gene Ontology富集分析，上述差異表達(dá)的基因主要涉及的生物學(xué)過程有淋巴細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)等，經(jīng)Pathway信號(hào)通路分析，上述差異表達(dá)的基因涉及的信號(hào)通路有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路、PPAR-γ信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等；與模型組相比，聯(lián)合組共有537個(gè)基因發(fā)生差異性表達(dá)，經(jīng)Gene On

11、tology富集分析，上述差異表達(dá)的基因主要涉及的生物學(xué)過程包括細(xì)胞周期調(diào)控、免疫及防御反應(yīng)、損傷修復(fù)、對(duì)激素的反應(yīng)等，經(jīng)Pathway信號(hào)通路分析，上述差異表達(dá)的基因涉及的信號(hào)通路有PPAR-γ信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。
　　結(jié)論：
　　1.阿霉素腎病的發(fā)生涉及眾多基因的改變，上調(diào)表達(dá)的趨化因子CCL20、CXCL9、CXCL10、CXC3R及集落刺激因子CSF-1、腫瘤壞死因子超家

12、族TNFSF9等參與的炎癥及免疫反應(yīng)在ADN發(fā)生中具有重要作用。p53信號(hào)通路可能通過促進(jìn)足細(xì)胞凋亡參與ADN的發(fā)生。
　　2.阿奇霉素可能通過下調(diào)編碼炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)控制炎癥反應(yīng)，并在免疫損傷的修復(fù)中發(fā)揮一定作用。阿奇霉素通過影響PPAR-γ信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)ADN大鼠脂質(zhì)的代謝。
　　3.潑尼松干預(yù)可能會(huì)抑制TGF-β信號(hào)通路，延緩ADN大鼠腎臟纖維化的進(jìn)展。潑尼松干預(yù)可能通過上調(diào)VEGF基因的表達(dá)降低ADN大鼠尿蛋白水