骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對阿霉素腎病大鼠的干預(yù)作用及mTOR的表達(dá).pdf

1、目的：1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymalstemcells，BMSCs）的分離及培養(yǎng)，并鑒定其相關(guān)生物學(xué)特性；
　　2、建立阿霉素腎病大鼠模型；
　　3、檢測生化指標(biāo)，電鏡觀察，應(yīng)用普通PCR和Western blot技術(shù)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對阿霉素腎病大鼠的干預(yù)作用及mTOR的表達(dá)。
　　方法：1、提取、培養(yǎng)與鑒定SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞---通過大鼠淋巴細(xì)胞分離液得到單個核細(xì)胞層

2、，再通過密度梯度離心法和貼壁篩選法，不斷傳代、擴增，并通過流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志物質(zhì)、同時運用成骨及成脂誘導(dǎo)方法鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性；
　　2、大鼠阿霉素腎病模型建立---非麻醉狀態(tài)下尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素，14天后，綜合各項結(jié)果：一般表現(xiàn)，24h尿蛋白定量、肌酐等各項生化指標(biāo)，結(jié)合腎臟組織HE染色及電鏡觀察大鼠阿霉素腎病模型；
　　3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對阿霉素腎病大鼠的干預(yù)作用及mTOR

3、的表達(dá)---實驗分組：模型組；MSC組；正常對照組；應(yīng)用普通PCR和western blot技術(shù)動態(tài)觀察足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTO R不同時間點mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、大鼠BMSCs細(xì)胞易于分離、培養(yǎng)，而且具有間質(zhì)細(xì)胞的表面抗原特征，純度高，活性高及多向分化潛能；
　　2、注射鹽酸阿霉素14天后，綜合各項結(jié)果判定本方法建立大鼠阿霉素腎病模型成功，可以實驗；
　

4、　3、干預(yù)后各時間點，PCR檢測模型組nephrinmRNA表達(dá)量均下降，隨時間推移下降越明顯，干細(xì)胞干預(yù)后nephrinmRNA表達(dá)量出現(xiàn)上升（較模型組），但相對于正常組仍然下降，Western blot檢測nephrin同上。干預(yù)后1周及3周，Western blot表明模型組mTOR條帶稍微增粗，p-mTOR條帶模型組也增粗，且經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)后條帶變窄，但相對正常組仍然變寬?；叶戎党霈F(xiàn)相應(yīng)變化，干預(yù)后2w，Western blot表

5、明模型組mTOR條帶稍微增粗，p-mTOR條帶模型組增粗較明顯，且經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)后條帶變窄窄，但相對正常組仍然變寬。灰度值出現(xiàn)相應(yīng)變化.
　　結(jié)論：1、可以通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法，成功地從大鼠骨髓中分離出高純度、高活性和具有多向分化潛能的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
　　2、可以經(jīng)尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素，建立大鼠阿霉素腎病模型，時間為14天；
　　3、MSC保護阿霉素腎病大鼠的可能機制是：M