禽類Ii基因的克隆、表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、Ii鏈?zhǔn)且环N非多態(tài)性的Ⅱ型跨膜蛋白，在調(diào)節(jié)MHCⅡ類分子的表達(dá)和功能方面發(fā)揮重要作用。人類和小鼠的Ii基因都是單拷貝基因，其mRNA都能夠以不同的拼接模式產(chǎn)生不同形式的Ii鏈異構(gòu)體。但是禽類Ii鏈?zhǔn)欠翊嬖诋悩?gòu)體還未見報(bào)道。我們利用RT-PCR和RACE的方法確定了兩個(gè)雞Ii鏈cDNA，并且用Southernblotting、Northernblotting和免疫熒光法分別檢測(cè)了Ii基因的拷貝數(shù)、mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)情況。被命名為雞Ii

2、-1的cDNA長(zhǎng)為1，151bp，含有一個(gè)由672bp組成的開放閱讀框，它與一個(gè)已經(jīng)被報(bào)道的雞Ii鏈序列相一致；另一個(gè)Ii鏈cDNA被命名為雞Ii-2，其大小為1,337bp，含有一個(gè)由861bp組成的開放閱讀框。Ii-1與Ii-2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性均為99％，兩者的區(qū)別在于Ii-2比Ii-1多出一個(gè)Tg區(qū)。Southernblotting結(jié)果表明，這兩個(gè)cDNA由一個(gè)單拷貝的基因產(chǎn)生。Northernblotting結(jié)果表

3、明，Ii-1和Ii-2在6周齡雞的脾臟和法氏囊中高表達(dá)，而在胸腺、心臟和肝臟中有Ii-1低水平表達(dá)，但未檢測(cè)到Ii-2的表達(dá)；在雞胚胎的晚期發(fā)育中，兩種Ii鏈異構(gòu)體在脾臟和法氏囊中均被檢測(cè)到高水平表達(dá)。脾組織切片的免疫熒光染色結(jié)果表明，Ii鏈主要表達(dá)在細(xì)胞膜上。這些資料表明，雞Ii鏈存在兩種異構(gòu)體，它們由mRNA的選擇性拼接產(chǎn)生，并且主要在免疫器官中高表達(dá)。 利用一對(duì)自行設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，通過RT-PCR和RACE方法，我們獲得

4、了鴨Ii鏈cDNA，并將其命名為鴨Ii-1。Ii-1長(zhǎng)為1，190bp，含有一個(gè)41bp的5'不翻譯區(qū)、一個(gè)669bp的開放閱讀框和一個(gè)480bp的3'不翻譯區(qū)。鴨Ii鏈也存在編碼含有Tg區(qū)的異構(gòu)體，我們將其命名為鴨Ii-2。鴨Ii-1與雞Ii-1氨基酸序列的同源性為82％，與哺乳動(dòng)物IiP31/P33之間的同源性約為60％。鴨Ii-2Tg區(qū)與雞Ii-2Tg區(qū)在氨基酸水平上的相似性高達(dá)96％，與哺乳動(dòng)物Ii鏈Tg區(qū)之間也達(dá)到70％。利用

5、一對(duì)能同時(shí)擴(kuò)增鴨Ii鏈兩種異構(gòu)體的引物，通過半定量RT-PCR檢測(cè)不同組織IimRNA的分布情況，結(jié)果表明，Ii鏈兩種異構(gòu)體在不同組織中廣泛表達(dá)，尤其在脾臟和法氏囊中高水平表達(dá)。應(yīng)用comparativeproteinmodeling分析了鴨Ii鏈三聚體區(qū)和Tg區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，它們與人Ii鏈相應(yīng)domain的結(jié)構(gòu)完全相似。這些結(jié)果表明鴨Ii鏈也存在兩種異構(gòu)體，它們主要在免疫器官中高表達(dá)，并且與人Ii鏈具有相似的結(jié)構(gòu)。 哺乳動(dòng)物I

6、i鏈的一個(gè)重要功能是確保新合成的MHCⅡ分子的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，MHCⅡ-Ii復(fù)合體的內(nèi)體分選信號(hào)已被證明為Ii鏈胞漿尾部的兩個(gè)獨(dú)立的亮氨酸基元，即Ii鏈胞漿尾部的Leu7/Ile8和Pro15/Met16/Leu17。雞Ii鏈及其異構(gòu)體胞漿尾部含有Leu8/Ile9和Gly16/％l17/Leu18。鴨Ii鏈含有第一個(gè)亮氨酸基元Leu8/Ile9，但是缺乏第二個(gè)亮氨酸基元(此處相應(yīng)的氨基酸為Gly16/％l17/Val18)。我們通過構(gòu)建GF

7、P-Ii融合蛋白，觀察GFP在293細(xì)胞內(nèi)的定位，結(jié)果表明，禽類Ii鏈及其異構(gòu)體都具有內(nèi)體定位功能。應(yīng)用大引物PCR突變法，將雞Ii鏈的第8位和第18位的Leu分別突變?yōu)锳la后，突變體的GFP都仍能定位于內(nèi)體。進(jìn)一步將雞Ii鏈的第8位和第18位的Leu均突變?yōu)锳la后，雞Ii鏈的內(nèi)體定位功能消失，這表明雞Ii鏈胞漿區(qū)也存在兩個(gè)獨(dú)立的內(nèi)體分選信號(hào)。將鴨Ii鏈的第8位的Leu突變?yōu)锳la后，突變體的GFP仍能定位于內(nèi)體，這說明鴨Ii鏈還存

8、在著不同于Leu7/Ile8的內(nèi)體分選信號(hào)。 我們通過構(gòu)建GFP-Ii/Ii-GFP融合蛋白、Ii1-83-GFP/GFP-Ii1-83的融合蛋白及在截短的GFP-Ii1-83基礎(chǔ)上對(duì)跨膜區(qū)氨基酸進(jìn)行突變的融合蛋白，利用免疫熒光和Westernblot對(duì)雞Ii鏈的裂解特性進(jìn)行初步的探討。結(jié)果表明，當(dāng)GFP位于完整的Ii鏈的C端時(shí)，Ii鏈在細(xì)胞中較易被蛋白酶降解；當(dāng)GFP位于Ii鏈的N端時(shí)，主要以完整的GFP-Ii融合蛋白形式存

9、在，GFP和Ii鏈均主要定位于細(xì)胞內(nèi)體。Ii鏈的跨膜區(qū)是Ii分子進(jìn)化中的最保守部分，據(jù)報(bào)道小鼠Ii鏈在第42位氨基酸Leu處存在裂解位點(diǎn)，且Ii鏈在該處的裂解是啟動(dòng)B細(xì)胞成熟的關(guān)鍵。因此我們對(duì)雞Ii鏈的跨膜區(qū)氨基酸進(jìn)行突變，但是幾個(gè)針對(duì)跨膜區(qū)的突變體C1-R31A(第31位Arg突變?yōu)锳la)、C1-RL31-34AV(第31位Arg和34位Leu同時(shí)突變?yōu)锳la)、C1-L43A(第43位Leu突變?yōu)锳la)和C1-AG46-47FF

10、(第46位Ala和47位Gly同時(shí)突變?yōu)镻he)在細(xì)胞中定位和產(chǎn)生的降解條帶與野生型的C1-ChIi83沒有明顯區(qū)別。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不支持雞Ii鏈可以在跨膜區(qū)發(fā)生RIP。 另外，由于雞MHCⅡ分子及Ii鏈與哺乳動(dòng)物的同源物之間不僅在氨基酸水平上具有很高的同源性，而且在分子結(jié)構(gòu)上很相似，因此它們應(yīng)該與其哺乳動(dòng)物的同源物一樣在外源性抗原提呈中發(fā)揮重要作用。但是目前還沒有關(guān)于雞MHCⅡ分子與Ii鏈之間的相互作用的報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)