家蠶UBRPS27a基因克隆、表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、泛肽-核糖體蛋白S27a(ubiquitin-ribosomal protein S27a，uBRPS27a)是泛肽和核糖體蛋白的融合蛋白，N端是泛肽，C端是有C2-C2型鋅指結(jié)構(gòu)域的高度保守的核糖體蛋白。在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，被酶解成泛肽和核糖體蛋白。N端的泛肽蛋白主要參與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)選擇性降解過程；C端的核糖體蛋白S27a在翻譯過程中不可缺少。已發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S27a在人結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)，是一個(gè)早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因；在胰腺癌細(xì)胞和臨近

2、胰腺癌細(xì)胞的癌前病變組織中也超常表達(dá)；在肝癌細(xì)胞里也高表達(dá)；在胃癌細(xì)胞中，該基因的表達(dá)也遠(yuǎn)高于胃正常黏膜上皮細(xì)胞?？傊?，這個(gè)多功能核糖體蛋白在各種活性增殖細(xì)胞和瘤組織中高度表達(dá)，在多種類型的腫瘤細(xì)胞中，該基因的過量表達(dá)是一個(gè)典型特征。 在對(duì)家蠶蛹cDNA文庫(kù)測(cè)序中，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼家蠶泛肽一核糖體蛋白S27a基因的序列，我們對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)的分析并將其命名為：BmUBRPS27a。為研究BmUBRPS27a的功能，將該基因的O

3、RF插入到融合表達(dá)載體pET-28a(+)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-BmUBRPS27a，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將裂解菌體的上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，與陰性對(duì)照相比在23.28 kDa處有一特異性條帶，與預(yù)期值一致。重組蛋白以可溶的形式表達(dá)，通過親和層析純化了重組蛋白并使用該重組蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，效價(jià)為1：51200。利用多克隆

4、抗體對(duì)家蠶UBRPS27a進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中都有分布。同時(shí)還進(jìn)行了熒光定量：PCR分析不同組織、時(shí)期該基因的表達(dá)差異，定量?jī)?nèi)參選用18srRNA，結(jié)果表明在各組織中，脂肪體和腸中的表達(dá)量最低，絲腺中表達(dá)量最高；在卵、幼蟲、蛹和蛾四個(gè)發(fā)育時(shí)期中，蛹的表達(dá)量最高，卵和幼蟲中表達(dá)量較低。我們合成了BmUBRPS27a的dsRNA進(jìn)行RNAi，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶卵巢上皮細(xì)胞：Bm5后，發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化：細(xì)胞由圓形、