禽類Piwil1基因與piRNAa生物學功能的初步研究.pdf

1、Piwi(P-element induced wimpy testis)基因參與生殖干細胞自我更新、減數(shù)分裂、RNA沉默以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。在模式生物上，研究發(fā)現(xiàn)piRNAs(Piwi-interacting RNAs)介導PIWI蛋白的表觀遺傳調(diào)控和轉(zhuǎn)錄初水平調(diào)控過程是生殖干細胞維持、配子形成以及受精的關(guān)鍵因素，但有關(guān)家禽Piwi基因的研究報道甚少。PIWI蛋白雖然廣泛存在于各種動物中，但大部分只局限在配子發(fā)生和胚胎發(fā)育早期表達，而且表

2、達模式也不一致，影響了其對生殖過程的具體作用機制的探討。就此而言，禽類配子、胚胎易于獲取且便于人工操作，具有其他生物無可比擬的優(yōu)越性，可為探討PIWI蛋白如何發(fā)揮調(diào)控作用的具體機制提供研究平臺。另外，作為人類主要的動物蛋白來源食品，家禽業(yè)生產(chǎn)正處于發(fā)展的關(guān)鍵時期，仍有不少問題亟待解決:一是繁殖力持續(xù)下降，商業(yè)品種中每年有5～12％的無精癥雞遭淘汰;二是如禽流感、白血病等一些RNA病毒，因其容易變異造成預防、治療失敗，給家禽產(chǎn)業(yè)帶來了巨大

3、的損失。本研究以中國地方雞種——狼山雞為研究對象，分別從基因克隆、基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能抑制等4個方面對Piwi like1(Piwil1)基因進行了較為全面系統(tǒng)的研究;并以日本鵪鶉為參照群體，分析了鵪鶉Piwil1基因和PIWI蛋白特異性結(jié)合piRNAs的表達譜，為探明Piwi基因在禽類中的生物學功能和家禽繁殖力的提高積累基礎(chǔ)資料，也為解析生殖細胞發(fā)生機制和發(fā)展新型RNA治療方法提供新的理論依據(jù)。
　　本研究首先參考GenBa

4、nk上紅色原雞Piwil1基因的mRNA序列，利用RT-PCR和RACE技術(shù)從12周齡狼山雞睪丸組織中成功克隆了Piwil1基因的全長cDNA序列，包括一個2604bp的ORF，161bp的5'UTR和660bp的3'UTR。生物信息學分析結(jié)果表明，該ORF編碼867個氨基酸殘基，含有PAZ和PIWI兩個Ago家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。啟動子區(qū)的序列特征分析結(jié)果表明，Piwil1基因的5'調(diào)控區(qū)存在著一個長489bp的CpG島，轉(zhuǎn)錄起始位點

5、上游-25～-30bp區(qū)域沒有真核基因啟動子區(qū)典型的DNA序列元件TATA box。
　　為了揭示雞Piwil1基因的組織、細胞表達模式，本研究利用Real-Time qPCR技術(shù)分別檢測了12周齡狼山雞不同組織（睪丸、大腦、下丘腦、腎臟、腎上腺、甲狀腺和卵巢）和不同類型生殖系細胞（PGCs、SSCs、精原/母細胞和成熟精子）中Piwil1基因的mRNA表達量。結(jié)果表明，Piwil1基因在睪丸組織的表達量顯著高于卵巢、腎臟等其他組

6、織;在睪丸精原和精母細胞以及成熟精子中的表達量顯著高于PGCs和SSCs細胞。Piwil1基因在成熟精子的高表達，推測Piwil1基因可能在精子授精過程中發(fā)揮作用。
　　為了探索Piwil1基因在雞精子形成過程中的重要作用，本研究利用Real-Time qPCR技術(shù)檢測了狼山雞5個發(fā)育階段（0、5、10、12、27周齡）6個組織（睪丸、大腦、下丘腦、腎臟、腎上腺和甲狀腺）中Piwil1基因的表達情況。結(jié)果表明，隨著周齡的增加，睪丸

7、中Piwil1基因的表達量不斷增加，而其他組織中Piwil1基因的表達量基本不變。在睪丸組織中，10周齡之前，Piwil1基因的表達量變化不大;10周齡之后，Piwil1基因的表達量急劇上升;27周齡時，Piwil1基因的表達量是0周齡時的35～40倍。性成熟后，Piwil1基因在睪丸組織中的表達量急劇增加，而且主要在精原（母）細胞和成熟精子中表達，推測Piwil1基因的高豐度表達應(yīng)該是維持雞精子發(fā)生所必須的。此外，本研究還檢測了Piw

8、il1基因在狼山雞上述5個發(fā)育階段卵巢組織中的表達情況。結(jié)果表明，隨著周齡的不斷增加，Piwil1基因在卵巢組織中的表達量逐漸降低。
　　為了探索Piwil1基因在雞胚性腺發(fā)育過程的重要作用，本研究利用Real-Time qPCR技術(shù)檢測了胚胎期雌雄雞胚性腺中Piwil1基因的表達情況。結(jié)果表明，在雄性睪丸組織中，Piwil1基因的表達呈雙峰分布，峰值分別位于第14.5天和第17.5～18.5天，推測此時Piwil1基因的高表達可

9、能與“DNA re-methylation”過程以及精原干細胞的自我更新有關(guān)。在雌性卵巢組織中，Piwil1基因的表達呈單峰分布，峰值位于第16.5～17.5天，此時初級卵母細胞已進入減數(shù)分裂Ⅰ前期，推測Piwil1基因可能在卵母細胞減數(shù)分裂Ⅰ過程發(fā)揮重要作用。
　　前期研究表明，Piwi基因主要在生殖系細胞中表達，具有生殖系特異性。通過前面的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雞Piwil1基因mRNA在不同組織和細胞中差異表達。為了探索雞Piwil

10、1基因選擇性表達的調(diào)控機制，本研究首先從基因組DNA水平通過啟動子區(qū)系列缺失法來尋找Piwil1基因的核心啟動子區(qū)。本研究將啟動子區(qū)的系列缺失片斷連接至熒光素酶報告基因5'端上游，成功構(gòu)建了7個含有雞Piwil1基因啟動子區(qū)序列的螢火蟲熒光素酶報告基因載體。然后，分別將這7個重組載體與海腎熒光素酶報告基因載體（內(nèi)參質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染GC-1細胞（生殖系細胞）和COS-7細胞（非生殖系細胞），熒光素酶活性檢測結(jié)果均表明Piwil1基因5'側(cè)翼區(qū)

11、-90～-43區(qū)域具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。
　　真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要依賴于順式作用元件和反式作用因子之間的相互作用。前面的結(jié)果已表明，Piwil1基因沒有真核基因啟動子區(qū)典型的順式作用元件TATA box。為了尋找核心啟動子區(qū)域的重要轉(zhuǎn)錄元件，本研究利用TFSEARCH軟件對Piwil1基因5'側(cè)翼區(qū)進行了預測分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，-90～-16區(qū)域含有CCAAT box（-56～-52，轉(zhuǎn)錄因子NF-Y的結(jié)合位點）和TCCC box

12、（-34～-31，轉(zhuǎn)錄因子Ik-2的結(jié)合位點）兩個轉(zhuǎn)錄元件。為了探討這些轉(zhuǎn)錄元件的生物學功能，本研究利用定點突變技術(shù)構(gòu)建了3個突變體，分別為CCAATbox單突變、TCCC box單突變和二者的雙突變。隨后，分別將這3個突變載體與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GC-1和COS-7細胞，熒光素酶活性檢測結(jié)果表明，與野生型相比，突變體的啟動子活性均發(fā)生了降低，這進一步表明CCAAT box和TCCC box可能對Piwil1基因啟動子活性具有重要作用。

13、r>　　前面的研究結(jié)果已表明，雞Piwil1基因在成年雞睪丸組織中高表達。但是，與哺乳動物相比，獲取雞睪丸組織曲精細管生精上皮中各級生精細胞的方法還不成熟。鑒于PGCs細胞是生殖祖細胞，雞PGCs中表達Piwil1基因以及PGCs體外獲得和培養(yǎng)相對成熟等優(yōu)勢特性，本研究選擇PGCs作為Piwil1基因功能研究的細胞模型。為了研究雞Piwil1基因在生殖系中的功能，本研究首先選擇基于DNA載體的RNAi技術(shù)——shRNA干擾表達載體來抑制

14、雞PGCs細胞中Piwil1基因的表達。結(jié)果表明，不同的siRNA靶序列具有不一樣的Piwil1基因沉默效果，Piwil1基因的mRNA表達量相應(yīng)地下降了9～36％。隨后，本研究檢測了在最佳干擾效果下CR1-B和CR1-F轉(zhuǎn)座子的mRNA表達量變化。與對照組相比，雞CR1-F轉(zhuǎn)座子ORF1 mRNA的表達量升高，這從一定程度上表明Piwil1基因具有抑制轉(zhuǎn)座子活性的功能。
　　為了提高siRNA在體內(nèi)的傳遞效率，本研究選擇基于慢病

15、毒載體的RNAi技術(shù)來抑制雞PGCs細胞中Piwil1基因的表達。首先，本研究通過分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建雞Piwil1基因過表達載體作為篩選miRNA干擾表達載體的靶質(zhì)粒。細胞定位結(jié)果表明，該Piwil1基因過表達載體能夠成功表達一種細胞質(zhì)蛋白。其次，本研究將miRNA干擾表達載體和Piwil1基因過表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，利用Real-Time qPCR技術(shù)篩選出具有最佳干擾效果的miRNA干擾表達載體。接著，本研究將該miRN

16、A干擾表達載體通過Gateway技術(shù)亞克隆至目的載體中成功構(gòu)建了Piwil1基因-miRNA慢病毒表達載體。最后，本研究將miRNA慢病毒表達載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞生產(chǎn)慢病毒顆粒。慢病毒液滴度為1×108TU/ml。細胞侵染結(jié)果表明，該慢病毒液能夠成功抑制Piwil1基因的表達。
　　為了檢測Piwi基因在物種內(nèi)的序列保守性，本研究以日本鵪鶉為參照群體，再次利用RT-PCR和RACE技術(shù)從成年鵪鶉睪丸組織中成功克隆了P

17、iwil1基因的全長cDNA序列，包括一個2595bp的ORF，142bp的5'UTR和667bp的3'UTR。生物信息學分析結(jié)果表明，該ORF編碼864個氨基酸殘基，含有PAZ和PIWI兩個Ago家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。與雞Piwil1基因編碼蛋白相比，N端缺失3個氨基酸殘基。在成年鵪鶉中，PIWIL1蛋白在睪丸組織中特異性表達，表明PIWIL1蛋白在雞和鵪鶉之間具有保守的功能。
　　為了進一步探索禽類PIWI蛋白在精子發(fā)生和轉(zhuǎn)座

18、子調(diào)控中的作用機制，本研究利用深度測序技術(shù)獲得成年鵪鶉性腺組織small RNAs表達譜。在睪丸組織中，small RNAs主要集中在24～27nt之間，主要定位于基因組中重復序列區(qū)域，其次是編碼基因序列，與果蠅中piRNAs的分子遺傳特征相類似，推測禽類piRNAs與果蠅piRNAs一樣，在生殖系中參與維持異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，抑制重復序列轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座。免疫沉淀的結(jié)果表明，與禽類PIWIL1蛋白相結(jié)合的主要是24～25nt之間的piRNA