鴨TLR4基因的克隆及其功能初步研究.pdf

1、Toll樣受體(Toll like receptor，TLRs)是一種介導天然免疫和獲得性免疫的病原模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs），能識別表達在病原微生物上的高度保守的病原相關分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)，并將信號向下游傳遞，啟動和調節(jié)機體的免疫反應。目前TLR4已成為TLRs家族之中研究最熱門的成員之一。TL

2、R4作為動物疾病易感性相關的候選基因，已被廣泛認可。且最近研究發(fā)現在豬、綿羊、小鼠等生物上存在TLR4基因的可變剪接體，而在鴨上是否也同樣具有可變剪接的形式，TLR4功能又如何，目前尚未見有報道。
　　本研究通過克隆、鑒定鴨TLR4基因及其可變剪接體，利用qRT-PCR分析各可變剪接體在鴨組織及在LPS刺激鴨胚成纖維細胞前后表達變化，確定主要剪接形式。并構建pcDNA3.1+-TLR4過表達載體，瞬時轉染到鴨胚成纖維細胞，利用po

3、lyI∶C和LPS模擬病毒和細菌來建立病毒和細菌感染模型，探討TLR4信號通路中IL-1β、IL6和MHCⅡ等相關基因表達變化，研究旨在初步探明鴨TLR4基因可變剪接形式的存在性，及闡述主要剪接形式的結構和表達特征，初步闡明TLR4基因在鴨抵抗細菌感染和病毒感染中的功能，為今后研究禽類天然免疫奠定基礎，同時也為培育天然抗病鴨品種提供基因資源。
　　1.本研究利用RT-PCR和LD-PCR技術，獲得了鴨TLR4基因CDS序列以及DN

4、A序列全長，結果發(fā)現，duTLR4基因長為2532 bp，包含3外顯子和2內含子，并獲得鴨TLR4基因一種新的可變剪接體(TLR4b)，長為3367 bp，經鑒定其剪接形式為跨內含子剪接。
　　2.采用qRT-PCR檢測兩種可變剪接體在各組織中的表達，結果發(fā)現在胸腺、肺、脾臟、肝臟、腎臟等組織中，TLR4a基因的表達量都遠高于TLR4b。通過構建LPS感染鴨胚成纖維細胞(DEF)模型，利用qRT-PCR方法檢測TLR4a、TLR4

5、b基因在空白組、LPS感染處理組不同感染點的mRNA表達量，結果表明，TLR4基因的表達主要以TLR4a為主，且在LPS抗原刺激后，DEF細胞中TLR4a mRNA表達量總體表現為先上升，后下降，而TLR4b表達總體變化不大，表明TLR4其功能主要取決于TLR4a。
　　3.為了進一步探討duTLR4a功能，構建了pcDNA3.1+-TLR4真核表達載體，瞬時轉染入DEF，經LPS和polyI∶C刺激后，qRT-PCR檢測結果顯示

6、，在LPS和polyI∶C刺激12h內，IL-1β、IL6和MHCⅡ表達量都升高，且具有時效關系。為進一步驗證TLR4a在抗病毒感染中作用，通過構建PolyI∶C感染雛鴨活體模型，利用qRT-PCR方法檢測TLR4a mRNA不同組織中的的表達量，結果表明，在polyI∶C等抗原刺激后，肺、脾臟等組織中TLR4amRNA表達量總體表現為先上升，后下降。實驗結果進一步證實了duTLR4不僅在機體抗細菌感染發(fā)揮作用，而且在抗病毒感染過程同樣