粟酒裂殖酵母核糖體蛋白RPL32-2的基因轉錄調控因子篩選研究.pdf

1、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的核糖體蛋白RPL32的兩個同源蛋白RPL32-1和RPL32-2在功能上既有類似可以相互替代的方面，同時也存在功能的分化。本實驗室在前期研究中發(fā)現，RPL32-1，-2這兩個同源蛋白在細胞不同生長階段具有不同表達以及不同的生理意義，當RPL32的總蛋白量保持不變時，同源基因相互競爭抑制另一個同源基因的表達;當細胞處于沉默狀態(tài)時，RPL32-1高表達抑制細胞分裂;而細胞處

2、于對數期時，RPL32-2呈現高表達促進細胞分裂。然而RPL32-1，RPL32-2為什么會在不同時期有不同的表達量？產生這樣功能分化的原因是什么呢？由此本文開展了RPL32-2轉錄調控因子的研究。
　　我們首先利用酵母單雜交技術對rpl32-2的啟動子的轉錄因子進行篩選。本研究構建了高質量的酵母cDNA文庫，利用構建的帶有rpl32-2啟動子的誘餌菌株，從cDNA文庫中篩選可能的rpl32-2轉錄因子，共獲得109個陽性克隆。對

3、獲得的陽性克隆cDNA序列分析，經過NCBI比對得出了43種可能的結合蛋白，通過統(tǒng)計學分析，出現頻率較高的可能的結合蛋白有6種，其中有五種核糖體蛋白RPS6-1，RPL5-2，RPS10-1，RPL27-1，RPL5-1以及一種翻譯延伸因子EF1B，其出現頻率分別為11.93％，11.93％，8.26％，6.42％，5.50％，11.01％。推測這些蛋白有可能是rpl32-2的轉錄因子。
　　為驗證上述假說，我們通過構建pGADT

4、7+ rps6-1，pGADT7+rps10-1，pGADT7+rpl5-1，pGADT7+rpl5-2，pGADT7+rpl27-1，pGADT7+ef1b重組質粒，通過再轉化實驗進一步驗證，結果發(fā)現RPL5-1，RPL5-2，RPS6-1均可能與rpl32-2的啟動子產生相互作用。我們得出結論RPL5-1，RPL5-2，RPS6-1都有可能是rpl32-2的轉錄因子。但由于單雜交實驗本身存在一定的局限性，存在假陽性的可能，所以我們需

5、要通過其他的驗證實驗。
　　本文針對rpl32-2啟動子與核糖體蛋白RPL5-1之間有無相互作用，通過染色質免疫共沉淀實驗(ChIP)從體內進行驗證。我們首先構建帶有RPL5-1-HA標簽的酵母菌株，利用HA抗體進行染色質免疫共沉淀，以ChIP的純化產物為模板進行PCR擴增，但并沒有從中擴增出rpl32-2啟動子DNA片段。所以我們得出結論，rpl32-2的啟動子與RPL5-1蛋白之間沒有相互作用，之前的單雜交實驗結果為假陽性。<