粟酒裂殖酵母box H-ACA snoRNA snR90的功能分析.pdf

1、　 本論文主要將研究集中在對粟酒裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的一新種boxH/ACAsnoRNAsnR90在核糖體25S上的假尿嘧啶化修飾作用的討論。粟酒裂殖酵母核糖體大亞基上的25S是主要的肽轉(zhuǎn)移場所，其修飾位點的研究對了解粟酒裂殖酵母核糖體結(jié)構(gòu)及功能的實現(xiàn)均有極大的意義。根據(jù)對編碼snR90snoRNA的基因分析表明，snR90基因位于一個非編碼RNA基因的外顯子中，該非編碼RNA基因的內(nèi)含子中還存在一個boxC/D類snoRNA(snR80

2、)基因，是一個十分具有研究價值的基因；再對snR90的結(jié)構(gòu)進行分析判斷估計該分子上應(yīng)該存在兩個假脲嘧啶化修飾位點。利用遺傳手段，以一個選擇性標(biāo)記基因Kanr將snR90snoRNA基因交換出來，對snR90snoRNA的基因進行敲除(knockout)，成功構(gòu)建了基因缺失株△snR90。通過選擇培養(yǎng)基初步篩選，然后利用雙引物PCR篩選出正確重組的成功缺失株，再對野生性與缺失株中提取的總RNA分別利用Northern雜交鑒定，既確定snR

3、90snoRNA在粟酒裂殖酵母中的穩(wěn)定表達，又可進一步確定snR90snoRNA基因缺失株△snR90的成功構(gòu)建。同時用野生株和缺失株做CMC-引物延伸實驗，分別驗證由snR90在核糖體25S上指導(dǎo)的假尿嘧啶化的兩個精確的修飾位點。最后通過用五個濃度梯度的接種量在23℃、30℃、37℃三個溫度梯度下，分別在含有抗生素G418與不含的普通培養(yǎng)基中的對比生長培養(yǎng)得出缺失型菌株的生長情況差異進一步了解snR90對粟酒裂殖酵母生長的影響作用。實