裂殖酵母核糖體蛋白基因rpl32-2的推測轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RPS601的驗(yàn)證及其下游靶基因ace2的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期不同階段，粟酒裂殖酵母核糖體蛋白基因rpl32-2的表達(dá)水平是不斷變化的，說明rpl32-2表達(dá)受到嚴(yán)密調(diào)控。進(jìn)一步，以rpl32-2的上游啟動子為誘餌通過酵母單雜交系統(tǒng)篩選到了粟酒裂殖酵母核糖體蛋白RPS601，推測RPS601可能是rpl32-2的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對rpl32-2進(jìn)行著轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控作用。本文首先通過EMSA（凝膠阻滯遷移率）實(shí)驗(yàn)從體外進(jìn)行驗(yàn)證。首先構(gòu)建并異源重組表達(dá)His標(biāo)記的RPS

2、601，經(jīng)過Ni-NTA agarose純化RPS601蛋白，并通過Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證;同時(shí)制備了熒光標(biāo)記的rpl32-2上游5個(gè)長度為200bp的啟動子片段，將標(biāo)記的啟動子片段與純化的RPS601蛋白孵育處理，進(jìn)行PAGE凝膠電泳，結(jié)果未出現(xiàn)蛋白RPS601與rpl32-2啟動子片段相結(jié)合的滯后條帶。其次進(jìn)行CHIP-PCR（染色質(zhì)免疫共沉淀）實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)作進(jìn)一步驗(yàn)證。利用同源重組方法構(gòu)建了His標(biāo)記的RPS601和對G4

3、18具有抗性的酵母突變菌株SP-Q01S;對SP-Q01S細(xì)胞進(jìn)行甲醛固定，解交聯(lián)，超聲剪切染色質(zhì)等操作，采用anti-His免疫沉淀染色質(zhì)上可能結(jié)合的RPS601-His蛋白，通過Protein G Agarose免疫沉淀anti-His與RPS601-His的復(fù)合物及與其相結(jié)合的染色質(zhì)DNA片段，Western Blot確定了IP中RPS601-His蛋白，富集純化DNA片段，以此為模板用采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)中

4、未擴(kuò)增出目的基因片段rpl32-2上游啟動子序列。以上EMSA和CHIP-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示RPS601與rpl32-2沒有相互作用，說明只通過單雜交篩選實(shí)驗(yàn)并不能確定蛋白和基因相互作用
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過比較野生型和過表達(dá)RPL32-2的粟酒裂殖酵母的基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜(Microarray)，發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母核糖體蛋白RPL32-2能夠激活與細(xì)胞分裂至關(guān)重要的基因ace2，促進(jìn)細(xì)胞的分裂，提示RPL32-2可能對ace2有轉(zhuǎn)錄

5、激活作用。本文利用酵母單雜交篩選系統(tǒng)，構(gòu)建了含有ace2上游啟動子和報(bào)告基因的誘餌菌，同時(shí)構(gòu)建了粟酒裂殖酵母野生菌株的cDNA文庫，通過酵母單雜交篩選系統(tǒng)從cDNA文庫中篩選ace2的轉(zhuǎn)錄因子，但在獲得的陽性克隆中沒有篩選到RPL32-2 cDNA的菌株，有可能是RPL32-2與ace2啟動子沒有相互結(jié)合作用。然而，本篩選系統(tǒng)篩選到了10種其他cDNA陽性克隆。這些cDNA編碼蛋白是否為ace2潛在的轉(zhuǎn)錄因子，有待后續(xù)EMSA和CHIP