嗜熱毛殼菌第七家族纖維素酶基因的克隆、表達(dá)與定點(diǎn)突變.pdf

1、嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophile CT2）是一種最適生長溫度較高的極端微生物，其產(chǎn)生的纖維素酶在高溫下可以保持優(yōu)良的催化活性，此特性利于纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用。本研究以嗜熱毛殼菌為研究對象，通過RT-PCR擴(kuò)增出編碼嗜熱毛殼菌外切纖維二糖水解酶CBH3及內(nèi)切葡聚糖酶 EG2成熟肽的基因，利用畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)體系分別對這兩個(gè)蛋白進(jìn)行了高效表達(dá)、純化及性質(zhì)研究；對外切纖維二糖水解酶CBH3進(jìn)行同源建模，選定了5個(gè)氨基酸位

2、點(diǎn)并且分別進(jìn)行了定點(diǎn)突變，利用畢赤酵母表達(dá)體系同樣對5個(gè)突變酶分別進(jìn)行了高效表達(dá)、純化及性質(zhì)研究。
　　酵母工程菌WTCBH3表達(dá)的CBH3酶，其蛋白分子量大小約為47kDa，最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH為5。該酶在70℃條件下保溫1h后，剩余酶活力仍有最高酶活的80％，具有良好的熱穩(wěn)定性。CBH3在50℃~60℃時(shí)，酶活力保持在最高酶活的90%以上，但當(dāng)反應(yīng)溫度高于65℃后，CBH3酶活力會隨著溫度的升高而迅速降低，當(dāng)溫度

3、達(dá)到70℃時(shí)，剩余酶活力不足20%；酵母工程菌WTEG2表達(dá)的EG2酶，其蛋白分子量大小約為45kDa，最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH為5，該酶在70℃條件下保溫1h后，剩余酶活力有70%。
　　外切纖維二糖水解酶Cel7B與CBH3的氨基酸序列相似度達(dá)到80.65%，且Cel7B的空間三維結(jié)構(gòu)已通過X射線衍射技術(shù)了解清楚，Cel7B各項(xiàng)參數(shù)符合同源建模的模板標(biāo)準(zhǔn)。將CBH3與Cel7B進(jìn)行同源建模后，選定了CBH3上5個(gè)與底

4、物結(jié)合相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)為突變位點(diǎn)。通過定點(diǎn)突變的方法，將5個(gè)選定的氨基酸分別突變?yōu)楸彼岷?，進(jìn)行酵母誘導(dǎo)表達(dá)、純化、收集蛋白，測定純化蛋白的酶學(xué)性質(zhì)，期待篩選出CBH3結(jié)構(gòu)域中底物結(jié)合區(qū)的關(guān)鍵氨基酸。
　　對純化的5個(gè)突變酶 CBH3-246Y、CBH3-250R、CBH3-261D、CBH3-337D、CBH3-391R進(jìn)行活性測定，5個(gè)突變酶的最適溫度均為60℃，最適pH均為5。5個(gè)突變酶的酶活力與原酶CBH3相比都產(chǎn)生了不同

5、程度的降低，其中突變體CBH3-391R的酶活力降低了約60%；突變體CBH3-246Y、CBH3-261D、CBH3-337D的酶活力均降低了25%以上。在反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，除CBH3-250R外，其它四個(gè)突變酶活力均降低到最高酶活的30%以下。
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷出，CBH3氨基酸序列中第246位的酪氨酸、第261位的天冬氨酸、第337位的天冬氨酸、第391位的精氨酸都是CBH3催化反應(yīng)過程中與底物結(jié)合相關(guān)的重要氨基酸