新型納米無定型磷酸鈣-聚乳酸復合材料聯(lián)合堿性成纖維細胞生長因子修復關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、關節(jié)軟骨的自我修復能力極為有限，由于創(chuàng)傷、腫瘤等原因引起的軟骨損傷很難自我修復，如果得不到有效的處理的話，往往會導致進行性的關節(jié)退變和骨關節(jié)炎的形成。臨床上治療軟骨損傷的許多傳統(tǒng)方法，如微骨折、軟骨下鉆孔、骨膜和軟骨膜移植術等均存在一定的不足。近年來飛速發(fā)展的組織工程技術為關節(jié)軟骨的修復帶來了新的思路。組織工程是應用細胞生物學和工程學的原理，對病損組織的結構和功能進行再生和重建的一門新興學科，其中新型支架材料的研制開發(fā)一直是組織工程的研

2、究熱點。本研究采用熱誘導相分離的方法制備出新型納米無定型磷酸鈣／聚乳酸(ACP／PLLA)三維多孔支架材料，并與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)相復合來探討它們在關節(jié)軟骨修復中的應用前景。 第一部分:ACP／PLLA復合材料的制備和表征 目的：通過對新型ACP／PLLA復合材料表征來評價其作為軟骨組織工程支架材料的可行性。方法：采用熱誘導相分離的方法制備ACP／PLLA復合材料，對該復合材料的顯微形貌、孔徑、孔隙率和力

3、學性能進行表征。觀察支架材料在浸泡PBS液后的形貌變化。同時將bFGF生長因子復合在ACP／PLLA材料上，檢測bFGF在PBS溶液中的緩釋情況。結果：用熱誘導相分離方法制備的ACP／PLLA復合材料是一種三維多孔支架材料，材料孔徑在100—200gm之間，孔隙率為91％，材料彈性模量為3.46Mpa。當材料浸泡在PBS液后，材料孔壁表面的ACP顆粒會發(fā)生形貌的變化，在原位轉變?yōu)槠瑺罴{米磷灰石晶體。當bFGF復合在ACP／PLLA材料上

4、后，bFGF在溶液中能實現(xiàn)緩釋。結論：基于組織工程對支架材料的微觀要求，新型．ACP／PILA復合材料可望成為一種理想的軟骨組織工程支架材料，它可作為生長因子的載體。 第二部分:骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及與復合材料的生物相容性研究 目的：探索兔子骨髓間充質(zhì)干細胞(bMSCs)的體外分離、培養(yǎng)方法，評價ACP／PLLA復合材料與bMSCs的生物相容性。方法：將抽取的兔子骨髓用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離bMSCs，在體

5、外進行細胞的原代和傳代培養(yǎng)，觀察細胞的生長情況。將第三代的bMSCs種植在ACP／PLLA和PLLA材料上，用MTT法檢測細胞在不同材料上的黏附和增殖情況，用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在材料中的生長情況和形態(tài)改變。結果：分離獲得的bMSCs在3天左右貼壁，并逐漸變?yōu)樗笮危?4天左右細胞長滿瓶底，而傳代后的細胞在7天左右就長滿瓶底。將bMSCs接種至ACP/PLLA和PLLA材料后，細胞在ACP／PLLA復合材料上的黏附率為77

6、.8％，而在PLLA材料中的黏附率為51.1％，兩者之間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。細胞增殖實驗結果顯示在種植后第3天和第6天，ACP／PLLA材料組和平板培養(yǎng)組的細胞數(shù)量明顯多于PLLA材料組(P<0.05)。之后，平板培養(yǎng)組的細胞增殖速度明顯減慢，而材料組的細胞仍保持較高的細胞增殖速度，在培養(yǎng)的第10天，ACP/PLLA材料組的細胞數(shù)量明顯多于PLLA材料組和平板培養(yǎng)組(P<0.05)。掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察證實在ACP／

7、PLLA材料組中bMSCs密度要明顯高于PLLA材料組。另外，掃描電鏡顯示bMSCs在．ACP/PLLA材料上黏附良好，并開始分泌細胞外基質(zhì)，提示bMSCs在材料中具有良好的活力。結論：用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法可以分離并培養(yǎng)得到bMSCs。與PLLA材料相比，ACP／PLLA復合材料更能促進細胞的黏附和增殖，ACP/PLLA復合材料是_種更具優(yōu)勢的軟骨組織工程支架材料。 第三部分ACP／PLLA復合材料聯(lián)合bFGF在兔子骨軟骨

8、缺損修復中的應用研究 目的：探索ACP／PLLA復合材料聯(lián)合bFGF生長因子修復關節(jié)軟骨缺損的可行性。方法：在21只骨骼發(fā)育成熟的兔子股骨內(nèi)髁制作直徑4mm，深5mm的骨軟骨缺損，在缺損處分別植入ACP／PLLA材料和bFGF的復合物、PLLA材料和bFGF的復合物或不做任何處理作為空白對照。在術后4周和12周取材，通過大體觀察和組織學切片觀察骨軟骨的修復情況，并對修復組織進行RT—PCR分析，檢測修復組織的基因表達情況。結果：

9、在術后4周時，ACP／PLLA／bFGF組和PLLA／bFGF組缺損內(nèi)均充滿一些不成熟的或纖維樣的修復組織，但沒有明顯的軟骨組織形成。在術后12周時，ACP／PLLA／bFGF組軟骨缺損表面覆蓋有一層典型的透明軟骨樣組織，在軟骨層下面也有一層連續(xù)的軟骨下骨形成。在PLLA／bFGF組中，修復組織主要為纖維軟骨組織，軟骨下骨形成不明顯。而空白對照組無論在4周還是12周缺損處凹陷明顯，表面只覆蓋有一薄層纖維組織，提示軟骨的自我修復能力很差。