青枯菌誘導(dǎo)的馬鈴薯防衛(wèi)相關(guān)基因克隆與表達.pdf

1、馬鈴薯(Solanumtubemsum)是重要的糧菜兼用作物，其適應(yīng)性強、豐產(chǎn)性好、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟效益高、適于加工，在食物安全結(jié)構(gòu)中具有舉足輕重的地位。馬鈴薯種植和生產(chǎn)常受青枯病(Raltoniasolanacearum)的嚴重威脅。因此加速病害控制和抗病育種研究顯得非常重要，這就迫切要求闡明馬鈴薯與青枯菌互作的分子機理，挖掘和利用優(yōu)良抗性基因用于馬鈴薯抗病遺傳結(jié)構(gòu)的改造。目前關(guān)于馬鈴薯應(yīng)對青枯菌的防衛(wèi)或抗病相關(guān)基因的種類、數(shù)量及其表達

2、調(diào)控等知之甚少。本論文針對馬鈴薯與青枯菌互作早期受病菌誘導(dǎo)的防衛(wèi)相關(guān)基因及其表達模式進行初步研究，目的在于為揭示馬鈴薯與青枯菌互作的分子機制提供一些有用信息。 本研究以傷根灌菌法接種馬鈴薯，應(yīng)用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建病原誘導(dǎo)后差異表達EST文庫;應(yīng)用SMARL技術(shù)構(gòu)建富集青枯菌誘導(dǎo)的防衛(wèi)相關(guān)基因cDNA文庫；從差異表達EST文庫中篩選與防衛(wèi)相關(guān)的增強表達基因片段，采用基因本體論(geneontology，GO)對其進行功能注釋和分

3、類：結(jié)合快速擴增cDNA末端技術(shù)獲得部分防衛(wèi)相關(guān)基因的全長cDNA，然后對其誘導(dǎo)表達模式進行qRT-PCR和Northern雜交驗證。主要結(jié)果如下: 1.通過構(gòu)建馬鈴薯與青枯菌互作早期受病菌誘導(dǎo)表達基因的差減EST文庫，篩選鑒定出上調(diào)表達EST共計189條。利用同源檢索結(jié)合GO術(shù)語(GOterm)初步確定了防衛(wèi)相關(guān)基因122個，它們分別屬于生物過程(25.42％)、分子功能(40.98％)、細胞組分(15.57％)。隨機抽取5條

4、EST做RT-PCR分析，證明其在病程早期明顯受到青枯菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達。 2.結(jié)合GO分類和先驗基因功能分析，展示了自根系接種青枯苗誘導(dǎo)感病馬鈴薯基因型防衛(wèi)相關(guān)基因的EST內(nèi)容；通過與同類病害的相關(guān)EST的縱向比較以及與另外一種維管束系統(tǒng)病害葡萄皮爾斯病病原苛養(yǎng)木桿菌誘導(dǎo)的葡萄EST轉(zhuǎn)錄譜的橫向比較分析，找出了它們與本研究中防衛(wèi)相關(guān)基因EST的異同；初步鑒別出一些可用于辨識抗性的關(guān)鍵防衛(wèi)基因，這些基因可用來作為開發(fā)抗病品種可能的

5、分子靶標(biāo)。 3.利用富集青枯菌誘導(dǎo)的防衛(wèi)相關(guān)基因cDNA文庫與RACE結(jié)合的方法，克隆了11條關(guān)鍵防衛(wèi)基因的全長cDNA，包括非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(StLTPa1,StLTPa7，StLTPb1，StLPTb3，StLTPf10)、印膜蛋白(StREMa4)、植物鐵蛋白(StFb8)、開心蛋白(StYPa5)、蛋白酶抑制予(StPIa3)、MBF轉(zhuǎn)錄因子(StMBFb7)、NAC轉(zhuǎn)錄因子(StNACb4)等。 4.結(jié)合青

6、枯菌誘導(dǎo)、化學(xué)處理、環(huán)境掃描電子顯微鏡和EDAX能譜分析，發(fā)現(xiàn)非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因StLTPa7在馬鈴薯與青枯菌互作早期表現(xiàn)與鈣相關(guān)、受病菌誘導(dǎo)的系統(tǒng)表達模式，非生物激發(fā)子水楊酸、茉莉酸、脫落酸以及一定濃度的氯化鈣能夠誘導(dǎo)該基因增強表達，鈣離子通道抑制劑釕紅可以抑制其表達；原位雜交顯示其轉(zhuǎn)錄物主要在馬鈴薯莖、葉維管束系統(tǒng)的韌皮部細胞中積累，暗示其在青枯菌入侵和定殖的微管束系統(tǒng)中發(fā)揮作用。StLPTa7基因可能參與馬鈴薯系統(tǒng)獲得抗性中

7、的長距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。對這種鈣離子相關(guān)的基因表達模式在抗病反應(yīng)中的作用機制提出了一個可能的工作模型。 5對另一個非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因StLTPa1的表達分析表明，該基因在馬鈴薯的抗病基因型和感病基崩型中差異誘導(dǎo)表達：在抗病基因型中的誘導(dǎo)表現(xiàn)得更快、更高、更強。在遠離根部接種位點的組織和靠近接種位點的組織中的表達差異明顯。該基因同樣受水楊酸、茉莉酸和脫落酸的誘導(dǎo)并產(chǎn)生一定時間的持續(xù)效應(yīng)。原位雜交結(jié)果顯示StLTPa1主要在馬鈴薯莖

8、、葉維管束系統(tǒng)的韌皮部細胞中表達。其表達特性與植物的抗病類型有一定的因果關(guān)系。 6.從馬鈴薯根際土壤和塊莖中分離到兩株低溫適應(yīng)型青枯菌菌株，對其進行微生物學(xué)、病理學(xué)特征分析和分子鑒定，發(fā)現(xiàn)其屬于青枯菌生理小種3號、生化變種2號，具有小菌落、小細胞、胞壁加厚、生長緩慢、細胞自聚、對固體培養(yǎng)基具強粘附性、潛伏感染等諸多小菌落變異株(smallcolonyVariats，SCVs)特征。檢測其潛伏感染馬鈴薯后，非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因

9、StLTPa7和StLTPa1的表達，結(jié)果表明SCV不能誘導(dǎo)這兩個基因的上調(diào)表達，說明該防衛(wèi)基因的表達與病菌的致病性相關(guān)。 通過文庫構(gòu)建、基因克隆及其表達模式研究，本論文確定了自根系接種的感病馬鈴薯基因型早期防衛(wèi)相關(guān)基因的種類、數(shù)量；初步確定了非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的表達模式；發(fā)現(xiàn)青枯菌誘導(dǎo)的馬鈴薯防衛(wèi)相關(guān)基因與苛養(yǎng)木桿菌誘導(dǎo)的葡萄防衛(wèi)相關(guān)基因在生物過程和分子功能方面具有很大的相似性，而在細胞組分上具有較大的差別，而且不同的接種方