青枯菌誘導(dǎo)的馬鈴薯防衛(wèi)相關(guān)基因克隆與表達(dá).pdf

1、馬鈴薯(Solanumtubemsum)是重要的糧菜兼用作物，其適應(yīng)性強(qiáng)、豐產(chǎn)性好、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)效益高、適于加工，在食物安全結(jié)構(gòu)中具有舉足輕重的地位。馬鈴薯種植和生產(chǎn)常受青枯病(Raltoniasolanacearum)的嚴(yán)重威脅。因此加速病害控制和抗病育種研究顯得非常重要，這就迫切要求闡明馬鈴薯與青枯菌互作的分子機(jī)理，挖掘和利用優(yōu)良抗性基因用于馬鈴薯抗病遺傳結(jié)構(gòu)的改造。目前關(guān)于馬鈴薯應(yīng)對(duì)青枯菌的防衛(wèi)或抗病相關(guān)基因的種類、數(shù)量及其表達(dá)

2、調(diào)控等知之甚少。本論文針對(duì)馬鈴薯與青枯菌互作早期受病菌誘導(dǎo)的防衛(wèi)相關(guān)基因及其表達(dá)模式進(jìn)行初步研究，目的在于為揭示馬鈴薯與青枯菌互作的分子機(jī)制提供一些有用信息。 本研究以傷根灌菌法接種馬鈴薯，應(yīng)用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建病原誘導(dǎo)后差異表達(dá)EST文庫(kù);應(yīng)用SMARL技術(shù)構(gòu)建富集青枯菌誘導(dǎo)的防衛(wèi)相關(guān)基因cDNA文庫(kù)；從差異表達(dá)EST文庫(kù)中篩選與防衛(wèi)相關(guān)的增強(qiáng)表達(dá)基因片段，采用基因本體論(geneontology，GO)對(duì)其進(jìn)行功能注釋和分

3、類：結(jié)合快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)獲得部分防衛(wèi)相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA，然后對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行qRT-PCR和Northern雜交驗(yàn)證。主要結(jié)果如下: 1.通過(guò)構(gòu)建馬鈴薯與青枯菌互作早期受病菌誘導(dǎo)表達(dá)基因的差減EST文庫(kù)，篩選鑒定出上調(diào)表達(dá)EST共計(jì)189條。利用同源檢索結(jié)合GO術(shù)語(yǔ)(GOterm)初步確定了防衛(wèi)相關(guān)基因122個(gè)，它們分別屬于生物過(guò)程(25.42％)、分子功能(40.98％)、細(xì)胞組分(15.57％)。隨機(jī)抽取5條

4、EST做RT-PCR分析，證明其在病程早期明顯受到青枯菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。 2.結(jié)合GO分類和先驗(yàn)基因功能分析，展示了自根系接種青枯苗誘導(dǎo)感病馬鈴薯基因型防衛(wèi)相關(guān)基因的EST內(nèi)容；通過(guò)與同類病害的相關(guān)EST的縱向比較以及與另外一種維管束系統(tǒng)病害葡萄皮爾斯病病原苛養(yǎng)木桿菌誘導(dǎo)的葡萄EST轉(zhuǎn)錄譜的橫向比較分析，找出了它們與本研究中防衛(wèi)相關(guān)基因EST的異同；初步鑒別出一些可用于辨識(shí)抗性的關(guān)鍵防衛(wèi)基因，這些基因可用來(lái)作為開發(fā)抗病品種可能的

5、分子靶標(biāo)。 3.利用富集青枯菌誘導(dǎo)的防衛(wèi)相關(guān)基因cDNA文庫(kù)與RACE結(jié)合的方法，克隆了11條關(guān)鍵防衛(wèi)基因的全長(zhǎng)cDNA，包括非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(StLTPa1,StLTPa7，StLTPb1，StLPTb3，StLTPf10)、印膜蛋白(StREMa4)、植物鐵蛋白(StFb8)、開心蛋白(StYPa5)、蛋白酶抑制予(StPIa3)、MBF轉(zhuǎn)錄因子(StMBFb7)、NAC轉(zhuǎn)錄因子(StNACb4)等。 4.結(jié)合青

6、枯菌誘導(dǎo)、化學(xué)處理、環(huán)境掃描電子顯微鏡和EDAX能譜分析，發(fā)現(xiàn)非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因StLTPa7在馬鈴薯與青枯菌互作早期表現(xiàn)與鈣相關(guān)、受病菌誘導(dǎo)的系統(tǒng)表達(dá)模式，非生物激發(fā)子水楊酸、茉莉酸、脫落酸以及一定濃度的氯化鈣能夠誘導(dǎo)該基因增強(qiáng)表達(dá)，鈣離子通道抑制劑釕紅可以抑制其表達(dá)；原位雜交顯示其轉(zhuǎn)錄物主要在馬鈴薯莖、葉維管束系統(tǒng)的韌皮部細(xì)胞中積累，暗示其在青枯菌入侵和定殖的微管束系統(tǒng)中發(fā)揮作用。StLPTa7基因可能參與馬鈴薯系統(tǒng)獲得抗性中

7、的長(zhǎng)距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)這種鈣離子相關(guān)的基因表達(dá)模式在抗病反應(yīng)中的作用機(jī)制提出了一個(gè)可能的工作模型。 5對(duì)另一個(gè)非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因StLTPa1的表達(dá)分析表明，該基因在馬鈴薯的抗病基因型和感病基崩型中差異誘導(dǎo)表達(dá)：在抗病基因型中的誘導(dǎo)表現(xiàn)得更快、更高、更強(qiáng)。在遠(yuǎn)離根部接種位點(diǎn)的組織和靠近接種位點(diǎn)的組織中的表達(dá)差異明顯。該基因同樣受水楊酸、茉莉酸和脫落酸的誘導(dǎo)并產(chǎn)生一定時(shí)間的持續(xù)效應(yīng)。原位雜交結(jié)果顯示StLTPa1主要在馬鈴薯莖

8、、葉維管束系統(tǒng)的韌皮部細(xì)胞中表達(dá)。其表達(dá)特性與植物的抗病類型有一定的因果關(guān)系。 6.從馬鈴薯根際土壤和塊莖中分離到兩株低溫適應(yīng)型青枯菌菌株，對(duì)其進(jìn)行微生物學(xué)、病理學(xué)特征分析和分子鑒定，發(fā)現(xiàn)其屬于青枯菌生理小種3號(hào)、生化變種2號(hào)，具有小菌落、小細(xì)胞、胞壁加厚、生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞自聚、對(duì)固體培養(yǎng)基具強(qiáng)粘附性、潛伏感染等諸多小菌落變異株(smallcolonyVariats，SCVs)特征。檢測(cè)其潛伏感染馬鈴薯后，非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因

9、StLTPa7和StLTPa1的表達(dá)，結(jié)果表明SCV不能誘導(dǎo)這兩個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明該防衛(wèi)基因的表達(dá)與病菌的致病性相關(guān)。 通過(guò)文庫(kù)構(gòu)建、基因克隆及其表達(dá)模式研究，本論文確定了自根系接種的感病馬鈴薯基因型早期防衛(wèi)相關(guān)基因的種類、數(shù)量；初步確定了非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)模式；發(fā)現(xiàn)青枯菌誘導(dǎo)的馬鈴薯防衛(wèi)相關(guān)基因與苛養(yǎng)木桿菌誘導(dǎo)的葡萄防衛(wèi)相關(guān)基因在生物過(guò)程和分子功能方面具有很大的相似性，而在細(xì)胞組分上具有較大的差別，而且不同的接種方