芝麻受青枯菌誘導(dǎo)前后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及水通道蛋白家族基因的鑒定.pdf

1、芝麻(Sesamum indicum)是重要的油料作物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。芝麻青枯病是影響我國(guó)南方芝麻產(chǎn)量及質(zhì)量的重要病害，由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，屬細(xì)菌病害。植物青枯病廣泛分布于溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)，致病菌株在世界范圍肉傳播擴(kuò)散，已成為第二大植物細(xì)菌病原。由于青枯病的土傳特性，使得該病的防治非常困難，迄今為止尚無(wú)有效的防治方法。目前，芝麻中還未發(fā)現(xiàn)高抗青枯病的種質(zhì)資源，開

2、展芝麻-青枯雷爾氏菌互作機(jī)制的研究，闡明病菌致病以及植物感病的機(jī)理有助于探索新的抗病育種策略。
　　本試驗(yàn)選取了芝麻受青枯菌誘導(dǎo)前后的三個(gè)不同時(shí)期，利用第二代高通量測(cè)序儀Illumina HiSeq2500對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，且每個(gè)時(shí)期做了兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)。共獲得了13.5Gb的數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣本2.25Gb。生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)性均較好，這表明此次試驗(yàn)的測(cè)序數(shù)據(jù)是可重復(fù)及可靠的。原始數(shù)據(jù)質(zhì)控后用TopHat2回貼到中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料

3、作物研究所已經(jīng)公布的芝麻基因組上，利用Cufflinks軟件根據(jù)回貼情況進(jìn)行表達(dá)定量和差異表達(dá)等分析。共得到了4367個(gè)差異基因，各比較組中下調(diào)基因均多于上調(diào)基因，S0 vs S1比S1 vs S2中差異基因數(shù)目多一倍多，表明發(fā)病初期芝麻莖部差異表達(dá)的基因明顯多于發(fā)病中期，初期轉(zhuǎn)錄組的變化更為顯著，可能是青枯菌侵染芝麻使其致病的關(guān)鍵性時(shí)期。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的聚類分析將所有差異基因分成了6個(gè)聚類群，不同聚類群的基因數(shù)目不一。在聚類分析的

4、基礎(chǔ)上通過(guò)agriGO對(duì)聚類群分開進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在碳水化合物代謝、催化結(jié)合、脂質(zhì)代謝和初級(jí)代謝等方面。不同聚類群之間富集到的功能有交叉也有不同，具有相似表達(dá)模式的聚類群聚集到的功能也相似。Pathway富集分析結(jié)果顯示，淀粉和蔗糖代謝和碳代謝在各個(gè)聚類群中均有相當(dāng)數(shù)量的基因分布，C2和C5中聚集到的代謝途徑主要有植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物病原菌的相互作用、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、過(guò)氧化物酶體和氨基酸生物合成。其中植物

5、病原菌的相互作用在C1和C6中也有顯著的富集，即包含上調(diào)表達(dá)基因又包含下調(diào)表達(dá)的基因。氨基糖和核苷酸糖代謝主要分布于C1和C4中，表明氨基糖和核苷酸糖代謝受青枯菌誘導(dǎo)后在芝麻莖部受到抑制。
　　通過(guò)生物信息學(xué)手段，結(jié)合芝麻基因組注釋信息，鑒定了36個(gè)芝麻AQP家族基因，根據(jù)多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析將其分為5個(gè)亞家族:13個(gè)質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP)、12個(gè)液胞膜內(nèi)在蛋白(TIP)、8個(gè)類NOD26膜內(nèi)在蛋白(NIP)、2個(gè)膜內(nèi)在小分子

6、堿性蛋白(SIP)和1個(gè)未知內(nèi)在蛋白(XIP)，其中有34個(gè)基因定位在12個(gè)連鎖群上。同一亞家族成員在基因結(jié)構(gòu)、蛋白序列、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及保守性氨基酸殘基等方面都較為相似。病菌誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示，NIPs、SIPs和XIPs表達(dá)無(wú)明顯變化，部分PIPs和TIPs能夠響應(yīng)青枯雷爾氏菌誘導(dǎo)。例如，SiPIP1;2、SiPIP1;3、SiPIP2;3和SiPIP2;4受青枯菌誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，SiPIP1;3和SiPIP2;3為持續(xù)上調(diào),而SiP

7、IP1;2和SiPIP2;4的表達(dá)先下調(diào)后上調(diào);與之相反，表達(dá)下調(diào)較為顯著的有SiPIP1;4、SiPIP2;1、SiPIP2;6、SiTIP1;1、SiTIP1;3、SiTIP2;1及SiTIP2;2。上進(jìn)差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。根據(jù)ar/R濾器和P1-P5氨基酸殘基的組成類型，我們預(yù)測(cè)了不同亞家族AQPs可能識(shí)別的底物。青枯菌誘導(dǎo)表達(dá)分析表明，部分PIPs和TIPs成員的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，可能在芝