植物青枯菌群體猝滅基因的功能研究及利用.pdf

1、植物細(xì)菌性青枯病是由茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種世界性重大病害。青枯菌的寄主范圍非常廣泛，涉及50多個科的200種植物，其中包括馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒、甘薯、花生、煙草、香蕉、桑樹、桉樹、油橄欖等許多重要的糧食、蔬菜及經(jīng)濟作物。 植物病原細(xì)菌毒性基因的表達受群體感應(yīng)(quorum-sensing)信號分子—AHL，(酰基高絲氨酸內(nèi)酯，N-acylhomoserinelactone)的調(diào)控

2、，降解細(xì)菌產(chǎn)生的AHL信號分子，猝滅其群體感應(yīng)，能夠降低細(xì)菌的致病力。 1.青枯菌aac基因的克隆及原核表達產(chǎn)物的功能分析 克隆了青枯菌的aac(aculeacinAacylase)基因，構(gòu)建了aac基因的原核表達載體，獲得了AAC融合蛋白，證實了AAC蛋白能夠降解細(xì)菌的AHL信號分子，猝滅細(xì)菌的群體感應(yīng)，明顯減弱病菌的致病力。 2.青枯菌aac基因突變株的構(gòu)建及其致病性分析 為明確aac基因在青枯菌致病

3、過程中的作用，構(gòu)建了aac基因重組自殺質(zhì)粒，并將其電轉(zhuǎn)化至青枯菌野生型菌株中，經(jīng)過體內(nèi)同源重組，獲得了aac基因插入突變株。接種番茄的結(jié)果顯示，aac突變株的致病性較野生型明顯下降，證明了aac基因在青枯菌致病過程中起重要作用。 3.抗青枯病轉(zhuǎn)aac基因煙草和番茄的培育 為進一步研究aac基因的功能，構(gòu)建了aac基因高效植物表達載體pBI121-Ω4A-aac，轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌，應(yīng)用葉盤法分別轉(zhuǎn)化至煙草和番茄。經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)及

4、卡那霉素(Kan)篩選，分別獲得了35株轉(zhuǎn)基因煙草和15株轉(zhuǎn)基因番茄。經(jīng)過PCR、RT-PCR、Southern、ELISA檢測，表明aac基因已經(jīng)成功整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，并得到正確的表達。接種青枯菌結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)aac基因煙草和番茄的抗病性明顯的增強，提高2-2.9個抗性級別，評價為中等抗病水平，表現(xiàn)為發(fā)病時間延遲，病情指數(shù)的降低。證明將青枯菌群體猝滅基因?qū)胫参?，是提高植物對青枯病抗性的有效策略?4.青枯菌毒性蛋白分